Testes in Vitro – não apenas para Claims de Produtos
publicado em 01/05/2024
Ana Carolina Kelmer, Georg Wiora, Christiane Uhl, Diana Khazaka
Courage-Khazaka Electronic GmbH, Colônia, Alemanha
É sabido que os métodos in vitro ainda não são capazes de capturar todas as reações complexas que ocorrem no corpo humano durante os testes in vivo. Neste artigo, os autores descrevem o estado de arte dessas metodologias e fazem uma previsão do que virá no futuro.
It is known that in vitro methods are not yeat capable of capturing all the complex reactions that occur in the human body during in vivo tests. In this article the autors describe the state of the art of these methodologies and make a prediction of what will come in the future.
Se sabe que los métodos in vitro aún no son capaces de captar todas las reacciones complejas que ocurren en el cuerpo humano durante las pruebas in vivo. En este artículo los autores describen el estado del arte de estas metodologias y hacen una prediccion de lo que vendra en el futuro.
Espectroscopia de Impedância Ultrassensível para substituir o Teste de Draize
A importância dos testes in vitro para a análise da pele e de suas funções tem aumentado continuamente nos últimos anos. Modelos de cultura de células e de tecidos semelhantes à pele humana que mimetizam as características e funções dessa pele estão prontamente disponíveis e proporcionam uma base controlada para numerosas análises, permitindo a realização de pesquisas para manipular variáveis com maior precisão.
A despeito de interações complexas entre um corpo vivo e o ambiente, os testes in vitro também oferecem a vantagem que os testes vão produzir resultados com alta taxa de reprodutibilidade. Isso permite estudar fatores específicos, como influências ambientais e genéticas na pele. Em particular para cosméticos e para pesquisas dermatológicas, os testes in vitro oferecem muitas vantagens.
As medições in vitro proporcionam insights precisos a respeito da absorção dérmica de substâncias, o que é crucial para a avaliação da segurança de cosméticos, medicamentos e outros produtos. Além disso, essas medições também desempenham um papel importante em relação aos aspectos tempo e dinheiro: os testes in vitro oferecem melhor custo-benefício e economia de tempo em comparação aos caros e demorados estudos in vivo.
Estudos com seres humanos são caros, pois os voluntários necessitam ser recrutados e periodicamente precisam ser avaliados quanto às suas condições de saúde. A versatilidade dos testes in vitro também permite que cientistas explorem variações na espessura da pele e como elas afetam a penetração e a eficácia dos ingredientes de cuidado da pele. Essa informação é vital para a adequação de produtos a diferentes tipos de pele e condições de uso.
Aspecto Ético
Outro fator determinante para a escolha dos testes in vitro é o aspecto ético. O uso de animais para testar substâncias químicas tem sido cada vez mais criticado, e os testes in vitro oferecem uma alternativa eticamente aceitável para a geração de dados significativos. Além disso, a eficiência dos testes em animais tem sido contestada, uma vez que as estruturas biológicas e os processos de seres humanos e de outros animais não podem sempre ser comparados um com o outro.
Na União Europeia (UE), são proibidos testes em animais com cosméticos e substâncias químicas que são fabricadas para uso exclusivo em cosméticos. De acordo com a Regulação Europeia de Cosméticos n.º 1223/2009,1 cosméticos cujos ingredientes tiverem sido testados em animais após a vigência dessa norma (iniciada em março de 2013) não podem ser vendidos legalmente na União Europeia. Muitos países, além dos da UE, oficializaram regulamentações similares a essa.
O crescimento da consciência sobre a necessidade do bem-estar animal e do banimento dos testes em animais enfatizaram ainda mais a aceitação e integração dos métodos in vivo.
Desafios Logísticos
Por último, porém não menos importante, a experiência com a pandemia da covid-19 deixou claro que as medições em seres humanos não podem ser anti-higiênicas, mas isso também traz desafios logísticos. Durante a pandemia, devido ao risco de infecção dos voluntários e dos avaliadores, e à falta de pessoal, em muitos laboratórios de avaliações em seres humanos foram suspensas por consideráveis períodos de tempo.
As medições in vitro têm se tornado cada vez mais importantes, pois representam uma alternativa segura e confiável para a obtenção de dados significativos, sem comprometer a saúde e a segurança dos avaliadores e dos voluntários.
Conduzir experimentos em culturas de pele facilita a triagem de múltiplas amostras, permitindo a realização de testes de múltiplas substâncias ou condições, simultaneamente. A recente incorporação do enfoque in vitro como método reconhecido para a avaliação da tolerância da pele e de outros parâmetros, em numerosas diretrizes e regulações, também enfatiza o relevante aumento desses métodos de teste.
Organizações como a European Centre for the Validation of Alternatives Methods (ECVAM), a Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) e a European Cosmetic Toiletry and Perfumery Industry Association (Colipa) já validaram muitos desses métodos.2-5
Medições Comuns in vitro
As medições in vitro comuns em cultura de pele incluem as que são citadas a seguir.
- Estudos de permeação: são pesquisas da penetração de substâncias através das camadas da pele.
- Avaliação da inflamação e resposta imune: é o estudo da resposta da pele a estímulos inflamatórios ou a desvios imunes.
- Análise de expressão de gene: consiste na análise da res posta genética das células da pele a vários fatores.
- Viabilidade celular e testes de proliferação: determina a saúde e o crescimento das células da pele dentro da cultura.
- Testes de citotoxicidade: avalia a toxicidade potencial de substâncias em células da pele.
Em muitos desses campos de aplicação, a avaliação da qualidade da barreira da pele, ou seja, da perda transepidérmica de água (TEWL), desempenha um papel importante. Quando a pele está danificada, a estreita coesão entre as células da pele está interrompida. Isso facilita a entrada de irritantes externos e resulta no aumento da evaporação da água através da pele.
Componentes “ativos” comuns que englobam esses estressores incluem: ceramidas, ácido hialurônico, niacinamida, entre outros. Procedimentos para medir a TEWL na pele humana in vivo para avaliar a qualidade de sua barreira têm sido descritos em numerosas diretrizes desde 1990.6-8 A medição da TEWL em seres humanos tem sido realizada intensamente em testes de produtos para apoiar os claims desses produtos: “restauração da barreira da pele”, “reforço da barreira da pele”, “reparo da barreira da pele” e muitos outros.
Testes in vivo em humanos, com aplicação de certas substâncias causam danos à barreira. Além de serem testes de custo relativamente alto, esses despertam preocupações éticas. Esses fatos promovem uma alta demanda por novos métodos para substituir esses testes in vivo.
Testes ex vivo e in vitro têm sido desenvolvidos, e muitos deles ainda estão aguardando aprovação oficial para serem reconhecidos como métodos substitutos para testes in vivo em animais e em seres humanos.9,10
Na pesquisa como de a TEWL é afetada e aumentada, produtos e ingredientes são aplicados em modelos de pele. Os resultados podem ser usados para entender se a substância está causando dano ou comprometendo a linha natural de defesa da pele, ou para provar se isso contribui, de fato, para a recuperação da barreira cutânea.
Em outras palavras, a medição da TEWL oferece informações sobre o potencial de “suavidade” ou de dano de ingredientes e formulações. Há muitos anos, as células de difusão de Franz têm sido usadas em testes in vitro para avaliar a difusão de ingredientes químicos para o interior ou através de pele excisada humana ou de animal. A Diretriz n.º 428, da OECD, descreve esses testes em detalhes.2 Os resultados desses testes são especificamente úteis para rastrear a permeação na pele, de ingredientes químicos de diferentes formulações, e para avaliar a absorção percutânea.
Na célula de Franz, a amostra de pele separa as duas câmaras de difusão da célula: a câmara doadora superior e a câmara receptora inferior. A câmara receptora é preenchida com fluído que é previamente aquecido à temperatura aproximada de 32°C, similar à temperatura da pele. O ingrediente químico que está sendo estudado é aplicado em cima da pele, por um tempo determinado e em condições específicas, antes de ser removido por um método de limpeza definido.
Durante o experimento, o fluido na câmara receptora é amostrado em diferentes pontos e tempos, e é analisado para detectar se há presença do produto de teste ou de metabólitos. Para resultados confiáveis, é essencial que a pele usada para esse teste não esteja danificada, mas sim totalmente íntegra.
A medição da TEWL com sondas especialmente adaptadas tem a finalidade de avaliar a integridade da amostra e também pode ser usada para medir a influência de danos na pele causados por ingredientes químicos. A sonda Invitro Tewameter VT 310 (Courage-Khazaka Electronic GmbH, Colônia, Alemanha) – Figura 1 – foi especialmente desenvolvida e é adequada para fazer medições com célula de Franz, emulando completamente a câmara doadora.
Dessa forma, a sonda pode ser colocada diretamente em cima da amostra de pele para que a perda de água calculada dessa amostra corresponda à TEWL, a qual é normalmente medida in vivo na superfície da pele e é expressa em g/h/m2. A câmara aberta da sonda oferece a possibilidade de aplicação de substâncias na amostra de pele, através do cilindro de mediação, e ao mesmo tempo permite medir a perda de água através da pele. Para testes que requerem quantidades muito altas de ingredientes químicos aplicados na superfície da pele, também é possível adicionar uma peça central que se encaixa perfeitamente na sonda e na câmara do receptor da célula de Franz sem nenhum adaptador de fixação.
Cultura de Células
No dinâmico campo de avaliação da pele, o uso de cultura de células para reproduzir a pele humana está emergindo como um método transformador para avanço da cosmética e para promover a saúde da pele.
Culturas de células, especialmente aquelas derivadas da camada mais superficial da epiderme cutânea, o estrato córneo, proporcionam um ambiente controlado para estudos dos efeitos dos produtos cosméticos e de cuidado da pele.
Esses modelos in vitro permitem aos pesquisadores que observem como diferentes formulações interagem com as células da pele humana e assim avaliem fatores como toxicidade, irritação e eficácia. As células de cultura humana e os modelos de tecido de pele são frequentemente usados em micropoços, também referidos como placas de multipoços.
As placas retangulares multipoços contêm determinado número de cavidades, denominadas “poços”, as quais são isoladas uma da outra e dispostas em “linhas” e “colunas”. As dimensões da placa-poço são perfeitamente definidas, tendo comprimento de 127,76 mm x 85,48 mm de largura, para atender às necessidades de estações de trabalho automatizadas.
Sua altura também é usualmente padronizada, podendo variar até certo ponto. Baseado nas dimensões definidas, há uma ampla variedade para que o número de poços possa ser usado na placa-poço. Eles podem ter os formatos de 6, 12, 24, 48, 96, 384 e 1.536 poços.
É preferível usar placas-poços com menor número de poços em experimentos que requerem áreas de cultura maiores ou condições mais complexas. Os poços estão disponíveis nestes diferentes formatos: F-fundo (fundo plano), C-fundo (fundo plano com cantos minimamente arredondados), V-fundo (fundo cônico) e U-fundo (com reentrância na forma de U).
Medições em cultura de células em multiplacas incluem a pigmentação da pele, o que tem influência em vários aspectos da fisiologia da pele e na resposta da pele a agentes externos. Os testes realizados nas culturas de célula que mimetizam vários níveis de pigmentação são usados, por exemplo, em estudos para se entender como os produtos interagem com melanócitos (células que são produtos de pigmentos) e seu impacto na proteção UV e na regulação da produção e da distribuição da melanina.
Esses fatores são relevantes no desenvolvimento de produtos que protegem a pele contra o Sol e a radiação UV, e para demonstrar o efeito dos produtos destinados a diminuir distúrbios de pigmentação, como a hiperpigmentação e a hipopigmentação. Além disso, a pigmentação é um fator observado nos testes de sensibilidade e irritação, e isso também é importante para determinar a eficácia de produtos para diferentes tons de pele.
As medições da TEWL em cultura de células em poços são outro importante parâmetro para avaliar o impacto de um produto de skincare na hidratação e na integridade da pele, e para avaliar alguns claims de produtos, como “melhora da barreira da pele” ou “aprimoramento da barreira da pele”.
Sondas de canal único medem cada poço separadamente, um após o outro, e não têm a capacidade de levar à obtenção de resultados significativos, uma vez que as culturas de célula em diferentes poços vão mudar rapidamente após serem retiradas da incubadora.
Sistemas multicanais, como o da sonda Tewitro TW 24 (Courage-Khazaka) – Figura 2 – oferecem a vantagem de medir todos os poços simultaneamente. Isso é compatível com o padrão das placas multipoços 24-poços. Essas placas-poços apresentam composição de seis linhas com quatro poços de medição cada uma.
A sonda é instalada em cima de cada uma de suas 24 pontas de medição, que se projetam para o interior de um poço. A ponta de medição é equipada com dois pares de sensores que medem continuamente a temperatura e a umidade relativa, indiretamente, capturando o gradiente de concentração de vapor de água do fundo do poço, através do modelo de pele, até a superfície.
Para evitar que o sensor toque no tecido de célula, a altura da sonda instalada acima da placa multipoços pode ser ajustada fixando-se espaçadores de regulagem de altura.
A medição da TEWL é conduzida antes da aplicação dos produtos e é novamente realizada após os produtos terem sido aplicados e absorvidos, durante a fase de incubação, e de seu resíduo ter sido removido pela limpeza do poço.
Seguindo um detalhado protocolo e usando uma placa de aquecimento de laboratório, os efeitos do produto na integridade das culturas de células podem ser facilmente demonstrados in vitro e distinto do estresse experimental que ocorre em testes in vivo.
Espectroscopia de Impedância Ultrassensível para substituir o Teste de Draize
Barreiras epiteliais formam as superfícies externas da pele e de muitos órgãos. Para estudar a segurança de substâncias químicas foi desenvolvido o conhecido teste de Draize.
A córnea, a camada mais externa dos olhos, age como uma barreira protetora dos olhos e como uma janela para a recepção da luz.
Entretanto, é natural que a escolha para prever o risco potencial causado por ingredientes químicos à pele e aos olhos humanos (citotoxicidade) e para classificar esse dano ao tecido como reversível ou irreversível tenha sido por longo tempo, avaliada pela irritação em olhos de coelhos albinos, o então chamado teste de Draize.
Ingredientes químicos que não causam danos para os olhos não requerem advertência na rotulagem dos produtos que os contêm e aqueles ingredientes que causam danos reversíveis ou irreversíveis ao tecido ocular são enquadrados na categoria 2 e na categoria 1, respectivamente. Entretanto, a previsão do risco potencial de um ingrediente químico é uma tarefa complexa, devido aos diferentes tipos de ingredientes e aos seus potenciais efeitos nos olhos.
Enquanto testes em animais, como o teste de Draize, mesmo sendo altamente criticados pelos consumidores ainda são largamente utilizados em alguns países, estratégias de testes “animal-free”, como os testes não invasivos com medições de TEER (transepithelial electrical resistance) em placas-poços de cultura de células, estão se tornando, cada vez mais, importantes na indústria. Isso porque esses testes estão proporcionando valiosas informações sobre a integridade e a saúde da barreira epitelial.
A espectroscopia de impedância elétrica (electrical impedance spectroscopy) é um método conhecido e valioso que proporciona dados quantitativos sobre a integridade da barreira e o crescimento de tecido após exposição a ingrediente químico, e que utiliza a medição das propriedades elétricas de modelos de pele.11
Uma corrente alternada de baixa frequência é aplicada na superfície da pele e são medidas a resistência elétrica da barreira epitelial e a mudança de fase do sinal. Quanto mais fácil a corrente fluir entre as células, menor será o valor de TEER.
Valor reduzido de TEER é indicação de comprometimento da barreira. Entretanto, medições convencionais de TEER são demoradas, portanto, custosas, uma vez que são feitas manualmente, poço por poço. Isso faz com que estudos com grande volume de amostras se tornem mais trabalhosos e reduzam a reprodutibilidade dos resultados. Em momentos críticos, como na aplicação de substâncias de testes em modelos epiteliais e em medições de TEER, é mostrada a desvantagem desse método. Além disso, eletrodos comuns de aço inoxidável ou de ouro são submetidos à alta impedância inerente ao sistema, que muitas vezes excede a impedância dos modelos de células.
Para superar essas limitações corriqueiras nas medições realizadas pelos instrumentos de TEER mencionados anteriormente pode ser usado um novo instrumento, o Cell Spectrometer CSM 2100 (Courage-Khazaka) – Figura 3. Trata-se de um espectrômetro de impedância semiautomático com eletrodo revestido com nitreto de titânio (TiN), o qual permite que a TEER possa ser acessada em 12,5 Hz e 1.000 Hz, em 24 poços simultaneamente, pelo tempo total de apenas de 15 segundos.
Esse método é bastante adequado para uso na epiderme humana, na epiderme humana reconstituída (RHE, do inglês, reconstructed human epidermis) e em camadas de culturas de célula.
Adicionalmente, um amplo espectro de impedância, de 1 Hz a 200 Hz, é disponibilizado em menos de dois minutos, suficientemente sensível para medir a integridade da estrutura da célula em níveis de célula única. Mudanças no espectro de impedância podem refletir em alterações na permeabilidade de íons e moléculas.
Análise não invasivas de TEER podem trazer uma valiosa contribuição para esclarecer diferenças na avaliação de riscos no campo da química. Com todo o espectro de impedância, mesmo mudanças sutis na cultura de célula, como as que são esperadas nos testes de eficácia realizados na indústria de cosméticos, podem ser reconhecidas rapidamente e são confiáveis.
Conclusão
Métodos in vitro não podem capturar todas as reações complexas que ocorrem no corpo humano durante os testes in vivo. No entanto, eles são uma parte indispensável do processo de avaliação dos efeitos dos produtos na pele. Eles precedem os testes in vivo em seres humanos porque são valiosos indicadores do comportamento potencial de agentes químicos quando estão em contato com o tecido cutâneo.
Os vários métodos de medição in vitro estão em ascensão e provavelmente terão um importante crescimento no futuro. Praticamente todas as grandes CROs (sigla do inglês contract reaserch organization, para designar os laboratórios de avaliação) para produtos cosméticos e farmacêuticos já oferecem uma gama de opções de testes in vitro. É impressionante notar que muito mais ainda pode ser pesquisado utilizando os métodos in vitro, especialmente agora que eles podem ser combinados com a inteligência artificial. Acima de tudo, os laboratórios de testes em animais vão agradecer.
Este artigo foi publicado na revista Cosmetics & Toiletries (Brasil) 36(3): 34-39, 2024
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2. OECD. Guideline 428 for Testing of Chemicals – Skin Absorp tion: in vitro Method. 2004. On-line. Disponível em: https://www. oecd-ilibrary.org/environment/test-no-428-skin-absorption-in-vitro-method_9789264071087-en. Acesso em: 3/5/2024
3. OECD. Test Nº 439: in vitro skin irritation. Reconstructed human epidermis test method. 2010. On-line. Disponíevl em: https://www. oecd-ilibrary.org/environment/test-no-439-in-vitro-skin-irritation-reconstructed-human-epidermis-test-method_9789264242845-en. Acesso em: 3/5/2024
4. OECD. Test Nº 431. In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) method. OECD Guidelines for Testing of Chemicals, Section 4. 2019. On-line. Disponível em: https://www.oecd-ilibrary. org/environment/test-no-431-in-vitro-skin-corrosion-reconstructed--human-epidermis-rhe-test-method_9789264264618-en. Acesso em: 3/5/2024
5. OECD. Test Nº 442E. In vitro Skin Sensitisation: In vitro Skin Sensi tisation assays addressing the Key Event on activation of dendritic cells on the Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation. 2023. On-line. Disponível em: https://www.oecd.org/env/test-no-442e--in-vitro-skin-sensitisation-9789264264359-en.htm. Acesso em: 3/5/2024
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