Avaliação da Segurança
Avaliação da Eficácia de Substâncias Ativas
Considerações Finais

De acordo com a definição oficial da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), os produtos cosméticos contêm substâncias naturais ou sintéticas para uso externo nas diversas partes do corpo humano – pele, sistema capilar, unhas, lábios, órgãos genitais externos, dentes e membranas mucosas da cavidade oral – com o objetivo exclusivo ou principal de limpá-los, perfumá-los, alterar sua aparência, corrigir odores corporais, protegê-los e/ou mantê-los em bom estado.7

Um produto cosmético de qualidade deve apresentar estabilidade, segurança e eficácia, sendo que a segurança é fundamental, pois o cosmético, diferentemente dos medicamentos, não pode causar nenhum efeito adverso ao consumidor. De acordo com a Anvisa, a empresa que produz cosmético(s) deve ter um dossiê de segurança e eficácia do(s) produto(s) à disposição das autoridades competentes. Além disso, os produtos cosméticos não podem apresentar “risco à saúde quando utilizados em conformidade com as instruções de uso e demais medidas constantes na embalagem de venda durante o seu prazo de validade”.7

Os produtos de higiene pessoal, cosméticos e perfumes são divididos em dois grupos de risco, de acordo a RDC n.º 7, de 10/2/2015. Os de risco grau 1 são produtos com propriedades básicas, que não precisam de informações detalhadas quanto ao seu modo de usar nem restrições de uso. Entre eles, podem ser citados: maquiagem, perfumes, sabonetes e shampoos. Já os produtos de risco grau 2 apresentam risco potencial, com indicações específicas e restrições de uso na embalagem e comprovação de segurança e eficácia no dossiê do produto.7

As substâncias ativas de um cosmético são aquelas responsáveis pelo conjunto de atividades ou efeitos que esse produto propõe aos consumidores (por exemplo, ação antiacne, ação antitranspirante, proteção ultravioleta). Os claims, apelos ou atributos que o produto apresenta em sua embalagem devem ser comprovados. Busca-se, também, o desenvolvimento de cosméticos com eficácia cientificamente comprovada, conhecidos como cosméticos funcionais, que têm substâncias ativas com atividades mais específicas e desenhadas cientificamente. Essas atividades, chamadas claims avançados, são: atenuação dos sinais de envelhecimento e tratamento da pele, tratamento de olheiras e clareamento da pele, entre outras.1,34

Para atestar ou predizer a segurança e eficácia das substâncias ativas ou do produto final, cinco tipos de ensaio podem ser empregados: os ensaios in silico, in chemico, in vitro, in vivo em animais e clínico. De acordo com a Resolução Normativa (RN) n.º 17, do Concea (Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal), no Brasil, a partir de setembro de 2019, os ensaios para a avaliação da irritação e corrosão da pele, irritação ocular e fototoxicidade, entre outros, anteriormente realizados em animais, deverão ser obrigatoriamente substituídos pelo ensaio in vitro alternativo validado e reconhecido pelo Concea. Essa normativa é válida em todo o território nacional, tanto para cosméticos quanto para medicamentos de uso tópico ou outros produtos que propõem a avaliação desses desfechos.6 Definiremos a seguir os tipos de ensaio e, posteriormente, a aplicação de cada tipo de ensaio de acordo com os desfechos pretendidos.

Ensaios in silico
Os ensaios in silico utilizam ferramentas computacionais para predizer a segurança de substâncias químicas. A estratégia utilizada pelos softwares dos ensaios in silico pode avaliar as propriedades biológicas da molécula ativa de forma bastante específica, por meio da análise da estrutura da substância química ou do receptor celular a que ela se ligará.49

Essa abordagem permite a triagem high-throughput de grandes bibliotecas químicas sem realizar experimentos físicos, permitindo a priorização de candidatos antes da necessidade de sintetizar as moléculas, o que pode ser um processo longo e caro. Também permite fazer melhor uso dos dados já disponíveis sobre as moléculas ativas, induzindo estudos para uma específica atividade biológica.26 Entre os estudos de segurança e eficácia já realizados em cosméticos utilizando ensaios in silico, estão: a avaliação de risco de preservantes,4 a busca por novos preservantes,35 e a avaliação da inibição de enzimas que combatem o envelhecimento da pele.16

Ensaios in chemico
O princípio de relacionar a química da reação orgânica com a toxicologia levou ao desenvolvimento de diversas abordagens que usam medidas experimentais ou calculadas de reatividade como base para a previsão de toxicidade química. A chamada metodologia in chemico refere-se a uma variedade de ensaios que medem e avaliam a reatividade química das substâncias. Embora o termo in chemico tenha ganhado espaço nos últimos anos, modelos de reatividade química foram relatados desde a década de 1930.2,13

Entre os estudos in chemico já realizados com cosméticos, estão: a avaliação de fotoestabilidade de filtros solares,24 ensaios de fotorreatividade de compostos antioxidantes,23,41 sensibilização cutânea pelo ensaio DPRA41 e atividade antioxidante por captura do radical DPPH.47

Ensaios in vitro
Desde 2003, a Anvisa reconhece o uso dos métodos in vitro como testes pré-clínicos para a análise de segurança de produtos cosméticos. Esse protocolo foi revisado em 2012, passando a incluir vários dos métodos validados e aceitos na União Europeia, bem como a avaliação in silico e a utilização dos dados existentes e dos princípios de extrapolação.6,14

Ensaios in vitro são aqueles realizados fora de um organismo vivo, por exemplo, a cultura celular em monocamadas ou em modelo de pele humana reconstituída. Quando um método alternativo in vitro considerado relevante e confiável é aprovado nos estágios de desenvolvimento, pré-validação, validação e revisão por especialistas e está em conformidade com os procedimentos realizados por Centros para Validação de Métodos Alternativos ou por estudos colaborativos internacionais, ele poderá ter aceitação regulatória internacional e vir a ser reconhecido pelo Concea RN n.º 17, de 3/9/2014.6 Em especial, os órgãos regulatórios recomendam a utilização dos ensaios pré-clínicos in vitro validados para a avaliação do potencial de irritação e corrosão ocular, da fototoxicidade e da absorção cutânea. Esses ensaios são indicados na RN n.º 18, do Concea, e serão abordados neste artigo.

Ensaios in vivo pré-clínicos
Ensaios in vivo pré-clínicos são aqueles realizados com organismos vivos, ou seja, com animais de experimentação. A substituição dos ensaios em animais por procedimentos e estratégias de ensaios alternativos mais relevantes e mais confiáveis para prever os potenciais riscos de produtos químicos e cosméticos para os seres humanos vem chamando a atenção de cientistas, políticos e consumidores. Essa substituição tem ocorrido porque, em muitos casos, apesar de os experimentos em animais serem considerados padrão-ouro, eles têm provado ser imprecisos devido à distância filogenética existente entre os seres humanos e os animais de teste e a falhas metodológicas.30 Além disso, a falha em prever a eficácia e a toxicidade nos ensaios pré-clínicos traz sérios atrasos no desenvolvimento de novos fármacos, desperdiçando os investimentos da fase clínica, ou seja, da parte mais cara do processo de desenvolvimento de novos medicamentos. Já em relação aos produtos cosméticos, muitos países deixaram de permitir a avaliação de ingredientes e produtos cosméticos em animais. Além disso, muitos ensaios in vitro e estratégias integradas envolvendo dois ou mais ensaios têm melhor correlação com a segurança em seres humanos que os ensaios em animais. Dessa forma, por questões éticas e até pelo alinhamento às tendências e legislações internacionais, os ensaios in vivo em animais não são mais utilizados na área cosmética.

Ensaios clínicos
Os ensaios clínicos são ensaios in vivo realizados em seres humanos. Esses estudos, que têm o objetivo de confirmar a segurança de uso de produtos em seres humanos, consistem em estudos de compatibilidade (condições maximizadas) e estudos de aceitabilidade (condições reais de uso). Há um valor preditivo nesses estudos, entretanto resultados negativos não significam ausência de eventuais reações nos consumidores, uma vez que esses ensaios são realizados em um número reduzido de voluntários.5

Os estudos de compatibilidade representam o primeiro contato direto do produto em seres humanos e são utilizados para comprovar a segurança do produto sob condições maximizadas, com controle padronizado da área e da quantidade de aplicação. É importante ressaltar que esses estudos só podem ser realizados após ampla busca, na literatura, de informações pré-existentes e a indicação, por meio de ensaios pré-clínicos, in vitro ou in vivo, quando necessário, de que os componentes da formulação não oferecem risco aos seres humanos. Esses ensaios de compatibilidade envolvem metodologias que podem ser aplicadas, de modo geral, com apósitos oclusivos ou semioclusivos (como os patch tests) ou em modelos abertos (open tests), baseados em critérios de avaliação padronizados e descritos em guias oficiais. Desse modo, obtém-se a comprovação da ausência de potenciais irritantes e alergênicos no produto em questão, sendo que esses testes devem ser conduzidos e coordenados por um dermatologista.

Já os estudos de aceitabilidade buscam comprovar, nas reais condições de uso, a ausência de possíveis irritações ou desconfortos em condições normais ou razoavelmente previsíveis de uso do produto. Nesses estudos também podem ser avaliadas possíveis reações subjetivas que não sejam necessariamente cutâneas, por exemplo, lacrimejamento, mas sem o objetivo de confirmar a ausência do risco de alergias. Os protocolos desses estudos consideram as condições de uso determinadas pelo fabricante, com critérios de inclusão e exclusão padronizados.

 

Avaliação da Segurança

A legislação é clara em relação à segurança dos produtos cosméticos, os quais não podem oferecer riscos à saúde. Assim, a empresa deve garantir que seu produto é seguro nas condições de uso, que as matérias-primas deste encontram-se dentro da faixa de uso permitida e que todas as recomendações das autoridades foram seguidas, inclusive em relação aos testes pré-clínicos e clínicos para a avaliação do perigo intrínseco das substâncias e do risco nas condições de uso do produto. Entretanto, alguns eventos adversos podem ocorrer com o uso de cosméticos, como irritação, alergia e coceira.5

A experimentação animal para a avaliação da segurança de substâncias e produtos cosméticos passou por um processo gradual de proibição na União Europeia, que culminou em seu banimento total em 2013. No Brasil, as resoluções do Concea (RN n.º 17 e RN n.º 18), publicadas em 2014, estabeleceram o prazo de cinco anos para que alguns métodos alternativos reconhecidos pela Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) fossem adotados de forma obrigatória em substituição aos ensaios em animais.6 Com esse banimento, algumas abordagens integradas para testes e avaliações (IATAs, sigla em inglês para Integrated Approaches to Testing and Assessment) estão sendo propostas e aceitas pela OECD. Essas abordagens são baseadas em estudos científicos para a caracterização de perigos intrínsecos de substâncias. Esses estudos incluem uma análise integrada das informações existentes, juntamente com a geração de novas informações, sobre essas substâncias, usando estratégias de teste.

As IATAs podem incluir uma combinação de metodologias e podem ser formadas integrando resultados de uma ou mais abordagens metodológicas, como as vertentes definidas previamente (in silico, in chemico, in vitro, ex vivo, in vivo) ou, ainda, as tecnologias omics, por exemplo, a toxicogenômica.43,57 Ainda, a via de efeitos adversos (AOPs, sigla em inglês para Adverse Outcome Pathways) tem sido muito estudada visando identificar uma sequência de eventos moleculares e celulares que precedam uma resposta tóxica do organismo após sua exposição a alguma substância.

As AOPs podem ser aplicadas como uma estrutura para desenvolver uma IATA, por exemplo, a detecção de uma ligação covalente entre proteínas e uma substância (hapteno), que poderia desencadear uma sensibilização cutânea, é considerada o primeiro evento-chave da AOP de sensibilização cutânea. O ensaio que estuda essa ligação é associado a outros na IATA para predizer o potencial sensibilizante de um composto.10,42

Irritação/corrosão

- Irritação/corrosão ocular: um dos primeiros efeitos adversos que pode ocorrer depois do uso de um cosmético é a irritação. Irritantes oculares podem causar danos à córnea, sendo que o potencial de irritação ocular pode ser avaliado por diversos métodos.

Entre os métodos in vivo, há o ensaio para a avaliação da toxicidade ocular aguda, chamado teste de Draize. Esse ensaio foi criado em 1940, pela Food and Drug Administration (FDA), em resposta aos danos irreversíveis, ocorridos na década de 1930, nos olhos de consumidoras, causados por uma máscara para cílios.20 O teste utiliza o coelho como modelo animal. Antigamente, eram utilizados, no mínimo, seis coelhos por teste. Entretanto, com a discussão do princípio dos 3Rs (Reduction, Refinement and Replacement), o teste, que era realizado em seis animais, passou a ser feito em três animais ou até em um, dependendo da resposta esperada.

Outra alteração importante realizada recentemente no teste de Draize (OECD TG 405) indica que, antes da avaliação no animal, devem-se fazer: ampla pesquisa na literatura sobre a própria substância ou substâncias com estruturas químicas semelhantes; avaliação das propriedades físico-químicas das substâncias ou do produto-teste; e ensaios in vitro, para somente depois avaliar a necessidade de realizar o teste no animal. Os experimentos e a morte dos animais devem ser realizados de forma humanizada, com o uso de analgésicos e anestésicos para minimizar a dor e o sofrimento do animal. O teste envolve a aplicação de 0,1 ml (ou 0,1 g de sólido) da substância-teste na córnea e no saco conjuntival do olho do coelho, seguida da observação por um período de até 21 dias, para a avaliação de sinais de irritação, incluindo vermelhidão e edema na conjuntiva, opacificação da córnea e alteração na íris.41,56

Embora esse teste não seja mais utilizado para a avaliação de segurança em cosméticos, ele gerou, ao longo dos anos, um grande banco de dados com informações de toxicidade que são utilizadas até hoje como parâmetros para a classificação do sistema GHS e que são padrão-ouro para a determinação da relevância e para se obter a acurácia de métodos in vitro alternativos.

Entre os métodos alternativos in vitro, alguns testes validados foram aceitos pela OECD e devem ser aplicados visando à classificação de risco da substância-teste. O primeiro teste, chamado teste de permeação da fluoresceína (fluorescein leakage – OECD TG 460), é um ensaio de citotoxicidade realizado em células da linhagem MDCK CB997 tubular epitelial, que são cultivadas em insertos semipermeáveis simulando o epitélio da córnea. Após esse ensaio, é possível classificar a substância como Categoria 1: efeito irreversível nos olhos deve ser marcado com o símbolo “corrosivo” sob as normas do United Nations (UN) Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS) Category 1. Entretanto, esse ensaio sozinho não é capaz de definir o risco oferecido pelo ingrediente e, como parte da estratégia, deve ser avaliado por outro método. Por exemplo, este método pode ser o ensaio de córnea humana reconstituída (reconstructed human cornea-like epithelium – RhCE), que avalia o potencial irritante ou não irritante dos tecidos, com base na viabilidade por MTT (>60%) (OECD TG 492).

Um ensaio mais rápido e simples é o teste de exposição rápida STE (short time exposure), que acessa a citotoxicidade de células SIRC (fibroblastos de córnea de coelho). Esse teste é realizado em cinco minutos, tem um modelo de predição de irritante (GHS cat I) ou não irritante e consegue diferenciar, entre os irritantes, se mínimo, moderado ou irritante severo (OECD TG 491).41

Utilizando tecidos ex vivo, há o ensaio de avaliação de opacidade e permeabilidade da córnea bovina (bovine corneal opacity and permeability – BCOP) e o ensaio do olho isolado de galinha (isolated chicken eye – ICE). Esse dois ensaios aproveitam os olhos de animais de abate para o consumo humano e podem ser usados para avaliar o potencial para irritação e corrosão ocular de substâncias a serem utilizadas ao redor dos olhos. Os efeitos tóxicos para a córnea avaliados são opacidade da córnea e sua permeabilidade à fluoresceína, avaliações que pode ser seguidas ou não de análise histológica. A opacidade da córnea atua como um indicador de desnaturação de proteínas, inchaço, vacuolização e danos ao epitélio e ao estroma da córnea. A permeação de fluoresceína da córnea é frequentemente usada como uma medida de permeabilidade. Já a análise histológica da córnea é com frequência incluída, como desfecho adicional, em modelos organotípicos, muitas vezes para distinguir casos “limítrofes”.41,56

Ainda para a região dos olhos, a Anvisa preconiza como ensaio clínico o teste de aceitabilidade ocular, para que seja verificada a segurança do produto para a região periocular. Esse teste é realizado sob a supervisão de um oftalmologista, que analisa os sinais clínicos visíveis, caso apareçam, na região da conjuntiva córnea e a modificação da secreção lacrimal.5

Já para o ensaio in silico, o foco passa a ser predizer se as substâncias-teste serão ou não irritantes para os olhos, para depois serem realizados ensaios in vitro. Dessa forma, alguns autores utilizam a abordagem QSAR, partindo de um banco de dados com milhares de irritantes oculares já conhecidos, e conseguem prever se a substância-teste será irritante ou não para os olhos.54,55

- Irritação cutânea: em relação à irritação cutânea, este é um dano considerado reversível. Já a corrosividade da pele é considerada um dano irreversível. O ensaio realizado em modelo de epiderme humana reconstituída (RhE) veio substituir o ensaio realizado em modelo animal (teste de Draize). É um teste único de substituição de testes de irritação e corrosão da pele in vivo, mas também pode ser um teste de substituição parcial quando dentro de uma estratégia de testes que necessite do modelo animal, como no desenvolvimento de alguns medicamentos (OECD TG 439, 431). A diferença entre o ensaio de irritação e o de corrosão está nos tempos de exposição à substância-teste nos modelos RhE e depois aos limites de viabilidade dos tecidos para o modelo de predição de cada teste (irritante, não irritante, não corrosivo, corrosivo 1A, 1B e 1C).

Quando a substância não é considerada irritante in vitro, a terceira etapa ocorre em um grupo de voluntários no qual a primeira concentração não irritante da substância é aplicada no dorso dos participantes por meio de um adesivo dérmico (patch test) que contém quantidades conhecidas da substância-teste em um veículo adequado.

Fotossegurança
A fototoxicidade é uma resposta aguda induzida por substâncias fotorreativas que foram ativadas pela luz e transformadas em produtos que são tóxicos para as células da pele. A fototoxicidade pode ser caracterizada como fotoirritação, fotossensibilização ou fotogenotoxicidade. A fotoirritação se assemelha a uma queimadura solar mais exagerada. Por sua vez, a fotossensibilização é induzida pela resposta imune pelo reconhecimento de produtos foto-haptenizados, por meio da apresentação de antígenos e do desenvolvimento de reação alérgica em caso de exposição repetida. Já a fotogenotoxicidade pode ocorrer quando o DNA é lesionado por uma substância fototóxica.

Para que essas substâncias se tornem fototóxicas (fotoirritantes, fotossensibilizantes ou fotogenotóxicas), elas precisam ter, em suas estruturas químicas, grupos absorvedores na faixa do ultravioleta e visível, como a presença de anel benzênico ou de anéis heterocíclicos, e precisam penetrar na pele para exercer sua fototoxicidade. A fototoxicidade também pode ser manifestada pela ingestão de alguns medicamentos, como antibióticos, anti-inflamatórios não esteroidais e anti-histamínicos.

Existem dois tipos de reação fototóxica. São eles: as reações fototóxicas do tipo I, que envolvem um fotossensibilizador e a transferência de elétrons para a molécula de oxigênio, formando radicais livres, como hidroxila, peróxido de hidrogênio e superóxido, que causam danos celulares; e as do tipo II, que, por outro lado, envolvem o agente excitado que transfere energia diretamente para o oxigênio, causando a formação do oxigênio singleto.22,41

Para a avaliação do potencial fototóxico de substâncias ativas em cosméticos, podemos primeiramente avaliar as propriedades químicas das substâncias por meio de métodos chamados in chemico, que são ensaios não biológicos, realizados em bancada. Esses tipos de ensaio são considerados rápidos e econômicos em relação a outros métodos (in vitro e clínico) e são muito aplicados nas primeiras etapas de triagem dos ingredientes selecionados para um produto. Isso pelo fato de que é possível determinar quais são as substâncias com maior probabilidade de gerar uma reação fototóxica nas próximas análises in vitro e clinicamente. Entre os métodos in chemico, estão estudos de absorção das substâncias no UV e no visível (Vis); estudos de fotoestabilidade das substâncias de forma isolada ou de suas misturas;22,23 e ensaios de fotorreatividade para a detecção da produção de espécies reativas do oxigênio (EROs) após a exposição à irradiação solar (geralmente empregando-se um simulador solar).22,41,50 Quando a substância estudada absorve no UV/Vis, ela apresenta fotoinstabilidade e é fotorreativa, havendo grande probabilidade de ser positiva para fototoxicidade.

Entre os ensaios biológicos in vitro, o teste de fototoxicidade in vitro 3T3 Neutral Red Uptake phototoxicity (3T3 NRU-PT – OECD TG 432) é o primeiro passo para avaliar o potencial fototóxico de uma substância. Entretanto, devido à sua alta sensibilidade (100%) para a identificação de ausência de potencial fototóxico, esse teste pode ser superestimado e produzir resultados falsos positivos. Caso uma substância apresente potencial fototóxico, um segundo ensaio envolvendo modelos de pele 3D (RhE), que têm estrato córneo, deve ser realizado para avaliar se essa substância penetraria até a epiderme viável para causar reações de fotoirritação.25 Esse teste também é adequado para substâncias lipofílicas e até mesmo formulações cosméticas que não são possíveis de serem testadas no 3T3 NRU-PT. Como o veículo influencia a penetração de substâncias na pele, ele também representa um importante parâmetro a ser considerado na avaliação de fotossegurança.25

Finalmente, a terceira etapa ocorre em um grupo de voluntários no qual a primeira concentração não fototóxica é aplicada no dorso dos participantes, por meio de um adesivo teste fotopatch (patch adesivo dérmico contendo quantidades conhecidas da substância-teste), por 24 horas. Após esse período, uma dose de irradiação de 5 J/cm2 é aplicada. Depois de três dias, a presença de eritema é avaliada nos pacientes.

Sensibilização cutânea
O processo de sensibilização cutânea ocorre quando há uma resposta imunológica relativamente rápida do organismo após a derme viável ser exposta a um agente sensibilizador.

Esse agente pode apresentar propriedades físico-químicas e/ou determinada estrutura molecular que pode interagir com proteínas da pele, o que desencadeia uma resposta celular com a liberação de citocinas e resposta nos linfonodos. Geralmente, a resposta no organismo aparece como uma dermatite alérgica de contato – caracterizada por vermelhidão localizada, inchaço, bolhas ou coceira –, que pode se desenvolver após o contato direto repetido com um sensibilizador (OECD IATA n.º 256).

Entre as AOPs para a sensibilização cutânea, há quatro eventos principais para serem avaliados. São eles: ligação covalente da substância ativa ou de seus derivados às proteínas da pele, também chamada de haptenização; ativação dos queratinócitos; maturação e mobilização das células de Langerhans e das células dendríticas dérmicas; e, por fim, apresentação de antígeno mediada pelas células dendríticas para células T e proliferação/ ativação de células T específicas ao sensibilizador (OECD IATA n.º 256). Para avaliar esse evento inicial molecular de contato entre o agente sensibilizador e as proteínas da pele in chemico, há um teste chamado ensaio para reatividade direta do peptídeo (direct peptide reactivity assay – DPRA). O teste envolve dois peptídeos sintéticos contendo resíduos de lisina e cisteína que são colocados em contato com a substância-teste para sensibilização cutânea, durante 24 horas, à temperatura ambiente, para que ocorra ou não uma reação química de depleção do peptídeo. A quantificação da depleção dos peptídeos é realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e um modelo de predição estima o potencial sensibilizador. Assim é possível classificar a substância-teste em não reativa, minimamente reativa, reativa e muito reativa (OECD TG 442C).

Entre os testes disponíveis para a avaliação in vivo, existe o ensaio de linfonodo local (LLNA), em que os sensibilizadores induzem uma proliferação primária de linfócitos, que são mensurados por marcação radioativa, bioluminescência ou ELISA. Essa proliferação é proporcional à dose aplicada e fornece uma medida de sensibilização (OECD TG 429). Já a avaliação clínica para sensibilização cutânea utiliza o patch test, conforme descrito anteriormente para avaliação da irritação.

Os métodos in silico conhecidos para a avaliação da sensibilização cutânea partem de uma biblioteca de dados anteriormente estudados e comprovados em modelos animais, in vitro ou humano, como LLNA, ligação de proteínas e patch test, e fornecem informações de alertas estruturais ou dados qualitativos que predizem se a substância avaliada é sensibilizadora ou não sensibilizadora. Entre as ferramentas existentes, estão: QSAR Toolbox, ToxTree, CASE Ultra, VEGA, TIMES, Derek Nexus, TOPKAT e Danish QSAR Database.8,53 A sensibilização cutânea in vitro pode ser avaliada pelo teste de ativação de linhagem celular humana ou pelo método h-CLAT, um teste de ativação de linhagem celular U937 ou U-SENS e pelo ensaio para interleucina-8 (IL-8 Luc)(OECD TG 442E). Todos eles são usados para apoiar a diferenciação entre sensibilizadores e não sensibilizadores cutâneos.

Genotoxicidade
A genotoxicidade define o potencial de um produto químico para danificar o DNA, o que pode acontecer por meio da interação direta da substância com o DNA, ou indiretamente, por meio da interação com proteínas que possam estar relacionadas à integridade do DNA. O dano resultante é reconhecido pela célula e pode ser reparado ou pode levar à morte celular.46

Entre os testes existentes para a avaliação da genotoxicidade, há o teste de micronúcleo e o ensaio de cometa. O teste de micronúcleo é um teste in vitro para a detecção de micronúcleos no citoplasma de células em interface e avalia a capacidade de os compostos provocarem mutações em cromossomos. Os micronúcleos podem se originar de fragmentos cromossômicos acêntricos (ou seja, sem um centrômero) ou cromossomos inteiros que são incapazes de migrar para os polos durante o estágio de anáfase da divisão celular. O ensaio detecta as atividades clastogênica e aneugênica em células que sofreram divisão celular durante ou após exposição à substância-teste (OECD TG 487).

Já o ensaio de cometa é um teste in vivo que avalia a quebra de fita de DNA em células eucarióticas. Isso resulta em estruturas semelhantes a cometas que, usando-se uma coloração fluorescente adequada, podem ser observadas por microscopia de fluorescência. Com base em seu tamanho, os fragmentos de DNA migram da cabeça para a cauda, e a intensidade da cauda do “cometa” em relação à intensidade total (cabeça mais cauda) reflete a quantidade de quebra de DNA (OECD TG 489).

O método in silico, como o QSAR, capaz de prever potenciais efeitos adversos por meio da estrutura química da substância- -teste, é amplamente usado para estudos que envolvem busca de novos medicamentos. Além disso, nas últimas décadas, houve novo interesse em suas aplicações também para a avaliação da segurança de cosméticos.3 Em 2017, a diretriz da International Conference of Harmonisation ICH M7,32 sobre impurezas de medicamentos, reconheceu a capacidade de o QSAR relacionar a estrutura química e a mutagenicidade/genotoxicidade bacteriana (teste de Ames). O guia ICH M7 recomenda que sejam utilizadas duas metodologias de predição que se complementam para avaliar a genotoxicidade in silico.

Absorção e permeação cutânea
No ensaio de absorção cutânea in vitro pode-se utilizar tanto o modelo de pele ex vivo humano quanto o de animal. Quando de animal, geralmente se utiliza pele de orelha de porco de abate para consumo humano, que normalmente seria descartada. A pele ex vivo pode estar viável, o que é preferível, uma vez que tem a capacidade de metabolização durante a absorção, mas o teste também pode ser realizado com a pele que não está mais viável (após congelamento). É aplicada de 1 a 5 mg/cm2 para sólidos e até 10 μl/cm2 para líquidos. Em até 24 horas é avaliada, no fluido receptor, a distribuição da substância-teste (OECD TG 428).

Para a permeação cutânea, uma técnica altamente utilizada na cosmetologia é a espectroscopia Raman confocal, que pode ser utilizada in vivo para a determinação das características de tecidos biológicos em diferentes profundidades da pele. Nessa técnica, há a irradiação do local de análise por um laser específico, sendo que a energia espalhada pela amostra traz informações sobre as ligações químicas, permitindo determinar o aumento ou o decréscimo da quantidade de determinado grupo molecular. Os dados desse equipamento podem ser obtidos e monitorados em tempo real, sem o uso de técnicas invasivas.11,19

 

Avaliação da Eficácia de Substâncias Ativas

Não existe um padrão de ensaios recomendados para a avaliação da eficácia de substância ativas em cosméticos como existe a avaliação da segurança, pois os claims são tão diversos quanto as possibilidades de avaliação desse efeito, seja in vitro, seja nos estudos clínicos. Entretanto, busca-se cada vez mais o uso de pele ex vivo humana ou de modelos de pele humana reconstituída nos ensaios in vitro, devido ao microambiente tridimensional ser semelhante ao nativo (o que é crucial para os ensaios de eficácia que dependem da interação das substâncias ativas com as diferentes camadas da pele, aumentando a predição dos resultados em seres humanos), o que é muito diferente e limitado no cultivo 2D de células.

Já em ensaios clínicos, as técnicas de biofísica e de análise de imagem da pele são amplamente utilizadas. Compreendem diversos equipamentos com diferentes princípios físicos e/ou físico-químicos que estudam a ação de um produto cosmético em reais condições de uso.

Uma grande gama de parâmetros pode ser avaliada pelo uso dessas metodologias, como: determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo; perda transepidérmica de água; propriedades mecânicas (viscoelasticidade e anisotropia); conteúdo de sebo, número e atividade das glândulas sebáceas, rugas, poros e manchas da pele, e microrrelevo cutâneo.18,48

Inicialmente, esses equipamentos eram utilizados na área dermatológica, para diagnósticos médicos, mas seu uso se expandiu para a cosmetologia devido à grande necessidade de avaliar a eficácia clínica dos produtos desenvolvidos. Atualmente, essas técnicas são utilizadas tanto em departamentos de P&D de indústrias cosméticas quanto em empresas especializadas ou em centros de pesquisas de universidades. Os resultados são obtidos de maneira objetiva, prática, criteriosa e em reais condições de uso, com dados quantitativos e qualitativos das características e propriedades da pele.39

Hidratação da pele
Para a análise clínica da hidratação da pele, o conteúdo aquoso do estrato córneo é um parâmetro muito utilizado e é obtido pelo instrumento Corneometer (da Courage + Khazaka, Alemanha). Essa avaliação se baseia no princípio da capacitância, que utiliza uma corrente de baixa frequência e é pouco afetada pela temperatura e pela umidade relativa do ambiente. O princípio da capacitância trabalha de acordo com a constante dielétrica da água e é capaz de medir uma profundidade entre 10 e 20 μm do estrato córneo, e cobre uma área de 49 mm². Nele, uma lâmina de vidro separa duas placas metálicas da pele e, quando aplicada sobre a superfície cutânea, é formado um campo elétrico, sendo que uma das placas fica com carga positiva e a outra com carga negativa, possibilitando assim medir a constante dielétrica de água, que é convertida em unidades arbitrárias, resultando no conteúdo aquoso do estrato córneo.15,39 Essa metodologia também pode ser aplicada ao couro cabeludo, para a avaliação da hidratação nessa região.

Ação antissinais para a pele
No inglês, o termo anti-aging vem sendo substituído por ageless ou por slow-age, com o intuito de ressignificar o sentido dessa palavra.28 Assim também, no português, o termo antienvelhecimento vem sendo substituído por antissinais. As alterações clínicas do envelhecimento ocorrem de maneiras variadas nos diferentes tipos de pele. Assim, o estudo dessas alterações também pode ocorrer de diversas formas.

Nos estudos in vitro, uma das formas de observar o efeito antissinais é por meio da detecção da atividade antioxidante de substâncias ativas cosméticas que entram em contato com a pele ou com os cabelos. Um exemplo de metodologia que, qualitativa e quantitativamente, pode avaliar o potencial antioxidante de uma substância ativa na pele é por meio da sonda fluorescente permeável DCFH2 -DA em queratinócitos ou em modelo de pele 3D. A avaliação da atividade antioxidante em modelo de pele 3D consegue provar a capacidade de a substância permear ou não até a epiderme viável, para exercer a atividade antioxidante, após absorção pela pele.50 Outra forma de avaliar in vitro os efeitos antissinais de produtos é dosar, em modelos de pele 3D, os colágenos tipo I e IV e o aumento da expressão de metaloproteinases de matriz, por imuno-histoquímica e por padrões histomorfológicos, além de desenvolver modelos de pele envelhecida (células de doadores com idade superior a 60 anos) ou fotoenvelhecida (por irradiação UV), para observar efeitos ageless de cosméticos que têm esse propósito.31,45

Nos estudos clínicos, essa avaliação pode ser realizada pelos parâmetros da elasticidade e das propriedades mecânicas da pele, das propriedades morfológicas e estruturais da epiderme, da ecogenicidade da derme, entre outros.37 Dentro da grande diversidade de metodologias clínicas disponíveis para a análise de produtos antissinais, destacamos a análise do microrrelevo cutâneo que avalia as alterações ocorridas na superfície da pele. Para isso, é utilizado o instrumento Visioscan (da Courage + Khazaka, Alemanha), que produz uma representação gráfica da pele sob iluminação especial, com uma câmera capaz de capturar imagens em diferentes regiões por profilometria óptica. Além da análise visual, os parâmetros SELS (surface evaluation of the living skin) permitem a avaliação quantitativa de maciez, rugosidade, aspereza e descamação da pele etc.21,51

Para a determinação das propriedades viscoelásticas da pele, um parâmetro muito importante relacionado ao envelhecimento, o instrumento Cutometer (da Courage + Khazaka, Alemanha), pode ser utilizado. Esse instrumento tem uma sonda com um orifício de 2 mm a 8 mm de diâmetro contendo um sistema de leitura óptico. Essa sonda, que mede a deformação da pele em resposta à sucção, ou seja, a pressão negativa criada pelo dispositivo de leitura, provoca sensível penetração da pele no orifício, o que permite medir o nível de penetração da pele. A leitura é obtida por um sistema de leitura óptico, sendo que a intensidade de luminosidade captada é proporcional à penetração da pele no dispositivo.12,17

A análise da espessura e da ecogenicidade da derme pode ser realizada por equipamentos de ultrassom de alta frequência.9 Os softwares acoplados a esses equipamentos traduzem as amplitudes desses ecos em uma imagem bidimensional colorida, na qual a ecogenicidade pode ser percebida em uma escala de cores predeterminada. Valores de ecogenicidade altos podem indicar que existe maior quantidade de componentes na derme, sendo esta uma característica observada em pessoas mais jovens.38,52

O microscópio confocal de reflectância a laser (reflectance confocal microscopy – RCM) foi desenvolvido para proporcionar a avaliação cutânea in vivo de maneira rápida e substituiu algumas análises que antes eram realizadas somente por meio da análise histológica de biópsias. Esse equipamento emite luz no comprimento de onda de 830 nm, que penetra na pele e gera imagens de alta qualidade para a visualização das estruturas teciduais e celulares da pele, a partir da reflexão da luz do tecido. Na análise do envelhecimento cutâneo, esta metodologia pode ser utilizada para o estudo de parâmetros como profundidade das papilas dérmicas, fibras de colágeno na derme, características de queratinócitos, entre outros.36,40

Clareamento da pele
Para a avaliação in vitro de claims de substâncias ativas clareadoras, a cascata da melanogênese pode ser avaliada tanto em cultura de células quanto em modelo de pele 3D. A avaliação pode ser por desfechos relacionados aos principais mecanismos de atuação bem como à inibição da síntese de melanina, principalmente por meio da inibição da tirosinase, na inibição da transferência da melanina aos queratinócitos, na descamação da pele para a remoção do excesso do conteúdo de melanina e na ação antioxidante.27 Esses mecanismos podem ser detectados nos tecidos via expressões gênica, ômicas e de imunofluorescência de proteínas.

Para o estudo clínico da pigmentação da pele e assim como a eficácia de produtos cosméticos com esse objetivo, podem ser utilizados equipamentos que medem a intensidade da luz refletida em comprimentos de onda específicos quando em contato com a superfície da pele. Entre eles, podem ser citados o Skin-Colorimeter (Courage + Khazaka, Alemanha), que permite a quantificação de parâmetros colorimétricos da pele por meio da emissão de luz monocromática. Também há o Mexameter (Courage + Khazaka, Alemanha), que emite uma luz em comprimentos de onda compatíveis com os cromóforos da pele, medindo assim a variação dos parâmetros de melanina e eritema.29 Além disso, pode ser usado o microscópio confocal de reflectância a laser, para fazer um estudo da epiderme, uma vez que, por meio da avaliação da morfologia celular cutânea, é possível identificar estruturas envolvidas no processo de pigmentação da pele, como acúmulos de melanina e melanócitos.33,40,44

Comedogenicidade e oleosidade da pele
A comedogenicidade é um processo decorrente da hiperqueratinização causada pela irritação da unidade pilossebácea, sem processo inflamatório visível. A avaliação de comedogenicidade deve ser realizada no mínimo em cinco voluntários de fototipos V e VI, com a aplicação em seu dorso, de forma padronizada, por um tempo de 28 dias. Antes de cada aplicação, são feitas as leituras clínicas de comedões na área em estudo, para que, na etapa final do estudo, sejam realizadas a biópsia com cola de cianoacrilato e a leitura dos comedões em microscopia óptica.5

Para realizar a análise da oleosidade da pele, podem ser citados dois sistemas diferentes, o Sebumeter e o Sebufix, ambos da empresa alemã Courage + Khazaka. O Sebumeter utiliza um cassete contendo uma fita translúcida de um polímero a qual, quando entra em contato com o sebo da superfície da pele, torna-se transparente. Essa transparência da fita é medida pelo reflexo da fonte de luz emitida pelo instrumento e quanto maior for a transparência, maior será a captação de luz e maior será a oleosidade da pele.17,39 O Sebufix, por sua vez, é um filme plástico que pode ser acoplado a um sistema com câmera (Visioscan, por exemplo), para realizar a análise da produção do sebo em tempo real. O Sebufix é produzido por um material absorvente que deve permanecer em contato com a pele durante o tempo de 30 segundos. Assim o sebo produzido nas aberturas foliculares é absorvido, formando manchas transparentes na fita. O número e o tamanho dessas manchas indicam a atividade das glândulas sebáceas. O software do instrumento analisa, na imagem obtida, os parâmetros como a percentual de área coberta por manchas, a área coberta por sebo (em μm2 ) e o número de manchas.

 

Considerações Finais

Por fim, podemos concluir que as diferentes metodologias in vitro apresentadas, que visam garantir a segurança de produtos cosméticos, apresentaram grande evolução nos últimos anos e são essenciais e, muitas vezes, muito relevantes para garantir a segurança não somente dos voluntários em testes clínicos de compatibilidade e aceitabilidade, como também do consumidor final. O alinhamento com pesquisas e a harmonização com legislações internacionais também facilita a exportação de nossos produtos.

Já em relação à eficácia, novos métodos e novas abordagens possibilitam a avaliação de novos mecanismos de ação e efeitos de produtos antissinais, de clareadores e de fotoprotetores que agregam valor ao produto cosmético. As inovações relacionadas aos métodos que avaliam a eficácia de produtos diante das suas reais condições de uso também têm papel fundamental para garantir a prova científica da eficácia dos produtos cosméticos para e aumentar a sua competitividade.

Renata Spagolla Napoleão Tavares é farmacêutica pela Universidade Federal de Ouro Preto (Ufop), mestre e doutora em Ciências, pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo – FCFRP-USP, no Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas na área de Concentração de Medicamentos e Cosméticos. Atualmente, é pesquisadora de pós-doutorado na GCell Cultivo 3D, em parceria com o Inmetro.
Izadora de Souza é farmacêutica graduada pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e mestre em Ciências Farmacêuticas pela mesma universidade. Atualmente, é doutoranda no Programa de Pós- -graduação em Ciências Farmacêuticas, da FCFRP-USP.
Maísa Oliveira de Melo é farmacêutica pela Universidade de Ribeirão Preto e mestre em Ciências pela FCFRP-USP. Atualmente, é doutoranda no Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da FCFRP-USP, na área de Concentração de Medicamentos e Cosméticos.
Lorena Rigo Gaspar é farmacêutica, com mestrado e doutorado pela Universidade de São Paulo e estágio de pós-doutorado no National Centre for Documentation and Evaluation of Alternative Methods to Animal Experiments (ZEBET), em Berlim, Alemanha. É professora associada de Cosmetologia na FCFRP-USP.

Este artigo foi publicado na revista Cosmetics & Toiletries (Brasil), 32(6): 2D-9D, 2020.