Cosméticos Anticaspa - I. Métodos de Medida de Eficácia

Parte Experimental
Resultados e Discussão

Leia também Parte II - Desenvolvimento de Novo Ativo

A definição científica da caspa ainda não está perfeitamente esclarecida. Apesar de médicos, principalmente, dermatologistas, diagnosticarem muitas vezes a caspa como seborrhea sicca, ainda deve ser esclarecido se esse tipo de afecção é em si uma doença independente ou um dos sintomas da dermatite seborreica. Entretanto, parece praticamente suficiente a nós, tecnlogistas de cosméticos, definir a caspa simplesmente como a escamação do couro cabeludo, um fenômeno particularmente desagradável. Existem numerosos preparados cosméticos comerciais para caspa que contêm muitos tipos de ativos anticaspa. A sua ação anticaspa é considerada como dependente praticamente do tipo e da concentração do ingrediente ativo usado. Considerando que esses tipos de preparações já são comercializados como cosméticos anticaspa, é importante avaliar em que extensão podem realmente prevenir a geração de caspa. 

Até agora foram propostos vários métodos de medida dos efeitos anticaspa, cada um possui méritos e deméritos, entretanto, o melhor método está ainda para ser determinado.^1,2,3,4,5 

Nesta situação, o principal objetivo em avaliar o efeito anticaspa de ingredientes recentemente desenvolvidos foi o de propor um sistema experimental que reproduzisse bem as condições reais de utilização e pudesse oferecer resultados reprodutíveis e objetivos. 

Considerando a patogênese da caspa, foram propostas a teoria de Vanderwyk et al^6,7 e, em oposição a esta, a de Kligman et al,^8,9 mas a discussão ainda não está definida. Os ingredientes anticaspa usados correntemente incluem piritionato de zinco, piroctonato de olamina e outros. Esses, apesar de apresentarem atividades bactericidas, evitam a formação de peróxido lipídico, proposto recentemente como causa adicional da formação de caspa. Por este motivo fica muito difícil determinar se a atividade bactericida desses agentes ativos agrava ou não a formação de caspa. 

Nossa opinião é que, se o efeito anticaspa for obtido por um agente com atividade não bactericida, então se poderá resolver a discussão causada por essas teorias opostas. O objetivo secundário deste estudo foi desenvolver um ingrediente ativo anticaspa que não possuísse atividade bactericida. 

A maioria dos cosméticos anticaspa existentes no mercado são detergentes formulados como shampoo e condicionadores. Os ingredientes anticaspa contidos neles são, portanto, enxaguados após o uso, exceto pequenas quantidades deixadas no cabelo e no couro cabeludo. Maior tempo de contato do ingrediente ativo com o couro cabeludo produzirá melhor efeito anticaspa e portanto, não é recomendável o enxague logo após a aplicação. 

Portanto, o terceiro objetivo do nosso estudo foi desenvolver produto de cuidado dos cabelos como tônico capilar ou condicionador, passíveis de permanecer no couro cabeludo mais tempo após a aplicação. 

 

Parte Experimental 

• Coleta. A coleta de caspa foi realizada através de métodos próprios desenvolvidos pelos autores. 

Os cabelos dos voluntários foram lavados e os fios soltos com caspa recolhidos e secos. A caspa foi posteriormente separada por um sistema de sucção. 

• Medida. A quantidade de escamas de caspa coletadas foi medida pelo método micro-Kjeldahl.¹⁰ O total de nitrogênio, calculado como o teor de proteínas, foi convertido na quantidade da amostra de caspa. 

• Tempo de renovação do estrato córneo. Desde de duas semanas antes do início do ensaio, os voluntários passaram a lavar e enxaguar os seus cabelos com shampoos ou sabões sem agente anticaspa. Foi proibido o uso de quaisquer outros cosméticos. Como a presença do cabelo poderia interferir nas medidas do tempo de renovação do estrato córneo no couro cabeludo, o local da medida, 2 cm de diâmetro, foi raspado com lâmina de barbear. 

Porções de 0.2 mg de cloreto de dansila, finamente triturado, a 5% em vaselina branca foram colocadas em câmaras de 19 mm de diâmetro. Estas foram recobertas com fita adesiva hipoalergênica e aplicadas no local de teste durante período de 24 horas. 

As câmaras e a fila foram ainda presas à pele através de um coloide flexível. Ao final do período de 24 horas, as câmaras foram removidas e os locais foram levemente limpos com esponja embebida em álcool para remover o cloreto de dansila remanescente da superfície da pele. Imediatamente após a retirada das câmaras, os pontos de teste foram examinados com fluorescência, usando-se luz negra, depois de quatro dias e, periodicamente, a cada dois ou três dias até que não existisse mais fluorescência em todos os pontos. A fluorescência dos folículos capilares e do cabelo esteve presente após o desaparecimento das manchas do estrato córneo. 

 

• Medida da quantidade de peróxido lipídico. A amostra de caspa dispersa em, aproximadamente 30 ml de metanol foi agitada e filtrada. O filtrado obtido foi concentrado a 10,0 ml e uma porção de 1,0 ml foi retirada para medida dos lipídeos por gravimetria. O restante foi usado para medir o peróxido lipídico pelo método TBA (com ácido tiobarbitúrico).¹¹ Foi medida a absorbância a 532 nm que pode representar a quantidade de tetraetoxipropano. 

• Medida do efeito antioxidante. Foi usado esqualeno como substância oleosa para a medida do efeito antioxidante. A escolha foi devido ao esqualeno representar o principal constituinte dos peróxidos lipídicos do couro cabeludo. 

Porção de 20,0 ml de solução a 2% de esqualeno em acetona foi colocada em frasco com tampa de rosca, ao qual foi adicionado 0,1 ml da amostra de teste (Tabela I) que contém ECPC (um derivado de vitamina E sintetizado recentemente, é o sal de potássio do éster dl-α-tocoferol fosfórico do ácido L-ascórbico).

A solução resultante foi evaporada até a secura, sob pressão reduzida, e o frasco então colocado, destampado, num recipiente mantido a 50°C, por 5 horas. A medida do peróxido lipídico foi realizada pelo método TBA. O controle foi preparado adicionando-se uma solução aquosa a 75% de etanol à solução de esqualeno em acetona e esta solução testada conforme os procedimentos descritos acima. 

O efeito antioxidante de cada amostra de teste foi avaliado usando os valores médios de antioxidação. 

• Medida do efeito de umectação. 

a) Medida da perda de vapor de agua. Uma amostra de teste de 10.0 μl foi gotejada em um pedaço de papel de filtro de 1,0 x 1,0 cm, medindo-se o curso de tempo da perda de peso 25°C e 50% UR (umidade relativa). Como a taxa de redução no tempo (-up/dt) é proporcional ao peso da amostra de este após ser deixada repousar por tempo determina do, é válida a seguinte relação: 

(-dp/dt)=kp onde p= -kt + C

sendo p o peso da amostra de leste, t, o tempo, k, uma constante e C, a constante da integração. Das equações acima, fica evidente, quando o peso das amostras é registrado em um gráfico em relação ao tempo à constante k, o menor valor para k, ou seja, a menor taxa de redução de peso, significará maior efeito de umectação. 

b) Medida da condutância da pele humana usando hidrômetro de superfície. Os voluntários eram 4 homens e l mulher saudáveis, adultos normais, com idades entre 25 e 31. O local de medida foi uma mancha no antebraço, lavado previamente com sabão. Vinte minutos após o voluntário ter entrado na sala climatizada (25°C e 50% UR), foi efetuada a medida da condutância, usando-se um hidrômetro de superfície da pele e o valor obtido foi usado como a condutância antes da aplicação da amostra. Se a condutância era elevada, considerou-se que a superfície da pele estava rica em umidade. Trinta segundos após aplicar 0,2 ml da amostra teste no local de medida, o excesso foi removido absorvendo em um pedaço de papel de filtro. Os valores obtidos depois de 10 a 20 min, l e 2 horas foram as condutâncias após aplicação da amostra de teste. 

A avaliação foi efetuada com cada voluntário, comparando-se o valor da condutância antes e depois da aplicação da amostra leste. 

• Análise dos lipídeos no couro cabeludo. Os lipídeos foram extraídos do couro cabeludo de 9 voluntários e tendo analisadas suas composições. A extração do lipídeo foi executada logo após a lavagem do couro cabeludo como shampoo especificado e após 5 ou 7 dias de período sem lavagem. A extração foi conduzida completando-se cada um dos 20 tubos de vidro, de 2,4 mm de diâmetro, com 50 μl de acetona e pressionando-se as extremidades dos tubos contra a pele da área occipital até a parte frontal do crânio. As soluções foram recuperadas após 10 segundos, reunidas, concentra das e analisadas a composição lipídica por CGL

• Atividade bactericida do EPC. A atividade bactericida do EPC foi verificada através do cultivo em agar, 3 dias a 37°C, de Pityrosporum ovale isolado do couro cabeludo com caspa (Tabela II). 

O crescimento foi lavado assepticamente com 5 ml de água destilada estéril. As suspensões foram liberadas dos agregados de microrganismos por agitação e usadas como inoculadores. 

Foram inoculados três meios de cultura. Ao primeiro foi adicionado 0,2% de EPC, ao segundo 0,02% piritionato de zinco e o terceiro, controle, não foi modificado. A contagem foi efetuada após incubação a 37°C por 5 dias. 

• Medida do efeito anticaspa. O efeito anticaspa das novas preparações de teste foi testado por aplicação duplo cego. Foram selecionados 158 homens, saudáveis, normais, como voluntários participantes deste estudo. 

Foram utilizadas duas amostras de teste, cujas fórmulas são mostradas na Tabela III. Estas duas amostras foram preparadas e ajustadas de tal forma que se parecessem idênticas no aspecto, cor, odor e propriedades (inclusive embalagens). Além disto, coletou-se randomicamente conteúdos destas amostras e levadas à análise para confirmar se haviam sido formulados corretamente. 

Os 158 participantes foram divididos em dois grupos: O primeiro recebeu as amostras de teste, e o segundo, o controle, as amostras placebo. Para período de controle de um mês (outubro), antes do início do teste, ambos os grupos receberam preparações capilares tônicas sem ingrediente ativo, seguindo o período de teste de 4 meses (novembro a fevereiro), durante o qual foi executada a aplicação de duplo cego para cada um dos grupos. 

Antes do início do teste, o coordenador designou cada voluntário, aleatoriamente, para compor um dos dois grupos e foi fornecida a cada um deles uma amostra, na qual estava afixado exclusivamente um número. O tônico de teste específico devia ser aplicado no couro cabeludo, em quantidade apropriada, duas vezes ao dia, pela manhã e a noite. Aos voluntários foi pedido, que durante o período de teste, fossem usados somente shampoos e condicionadores sem ingredientes ativos. Foram fornecidos outros cosméticos capilares, sem ingredientes ativos, e permitido o seu uso sem restrições. 

A coleta da caspa foi efetuada a cada mês, adotando-se uma semana arbitrária, dentro do mês, como a semana de coleta, a coleta era feita de terça-feira a sexta-feira. Durante essa semana foi solicitado aos voluntários para que só lavassem os cabelos uma vez por dia, usando o shampoo e o condicionador recomendados. Fora da semana de coleta da caspa, foi permitido aos voluntários que lavassem os cabelos em intervalos livres, porém com os mesmos produtos. 

A coleta e medida da quantidade de caspa foram efetua das de acordo com os procedimentos descritos anteriormente. 

Foram eliminados da análise os casos que se encontravam nas seguintes condições: 

1 - Quando foi usado, no período de testes, outro shampoo ou produto de cuidado do cabelo indicado para a prevenção da caspa. 

2 - Quando, antes do início do teste, apresentou quantidade padrão de proteína de caspa menor que 3 mg/dia. 

3- Quando faltaram dados do 4° mês (avaliação final). 

4 - Quando faltaram dados padrão necessários ao início do teste. 

Com intervalos de um mês, foi calculada a quantidade média de proteína de capa, usando-se amostras de caspa coletadas 4 vezes, esse valor foi usado como a quantidade diária de proteína da caspa para cada mês. 

Para determinar a eficácia, foram utilizados os dados de 4°més como avaliação final. Como referência, foi efetuada análise estatística a cada mês. Além disto, foi usado 5% como o nível de significância na análise de séries de tempo levando-se em consideração a multiplicidade dos dados. 

 

Resultados e Discussão

• Medida e a variação sazonal na geração da caspa. Partindo-se da hipótese que os microrganismos do couro cabeludo têm uma função na patogênese da caspa, a medida da atividade antibacteriana¹² e a contagem dos corneócitos, método para quantificação e visualização da porção de descamação do estrato córneo humano,¹³ foram amplamente utilizados na indicação do efeito anticaspa. No entanto, estes dois métodos determinam somente características substitutivas para cam, não a atividade anticaspa em si. 

Apesar de serem solicitados ensaios clínicos utilizando couro cabeludo humano para determinar os efeitos reais dos produtos anticaspa, o problema está no fato de como deve ser determinada a quantidade de caspa gerada. Até agora foram propostos vários procedimentos subjetivos para avaliar a severidade da casa. Estes dependem, principalmente, de um observador treinado (normalmente um dermatologista) que avalia a severidade das condições em uma escala arbitrária.¹⁴ Foi estudada a variação sazonal na geração de Caspa com a participação de 150 voluntários, por período de 13 meses de junho de 1986 a junho de 1987, medindo-se mensalmente a quantidade de caspa gerada. 

As quantidades médias de caspa geradas nos 150 voluntários apresentaram aumento relativo durante o inverno, comparado com a quantidade durante o verão (Figura l). A Figura 2 apresenta as estatísticas da variação sazonal individual no período de um ano. 

O método geralmente adotado para avaliar o efeito dos produtos anticaspa é o denominado método de meia cabeça,¹⁴ com o objetivo de comparar a geração de caspa no lado direito e esquerdo do couro cabeludo de um voluntário. 

Este método não pode, entretanto, ser sempre considera do como satisfatório devido à dificuldade em tratar a linha divisória direita/esquerda, resultando em interferência nos dados. Existe dificuldade em analisar os dados obtidos devido à geração de caspa basal oblíqua nos hemisférios, exceto nos casos onde a geração homogênea de caspa é esperada em todo o couro cabeludo. Neste contexto, foi adotada uma abordagem total da cabeça ao desenvolver um novo método de avaliação dos efeitos anticaspa. 

A determinação quantitativa da caspa obtida foi efetuada medindo-se o seu teor de nitrogênio, já que a caspa ocorre como estrato córneo descamado, consistindo essencialmente, de proteína. Como a caspa inclui adicionalmente lipídeos pequena quantidade de poeira estranha, foi adotado um método micro-Kjeldhal para medir o teor de proteína. Já que o cabelo também consiste de proteína e a sua presença concomitante interfere no teste, na coleta da caspa foi necessário remover completamente o cabelo solto, mesmo o velo. 

Com relação à variação sazonal na geração de caspa, outros autores pesquisaram o número de pacientes, tendo a caspa como a principal queixa, que relataram que a formação da caspa diminui no verão, aumentando no inverno (de novembro a dezembro).¹⁵ Mencionaram que o motivo da descoberta acima estaria associado à frequência da lavagem do cabelo.¹⁵ 

Os objetivos do presente estudo foram, primeiramente, pesquisar a variação sazonal na geração da caspa e, em segundo lugar, confirmar a crença estabelecida de que a caspa depende da frequência de lavagem do cabelo. Por este motivo, foram eliminadas as possíveis causas da geração da caspa até onde pudemos alcançar. Os esportes foram proibidos somente durante a semana experimental, já que os esportes interferem no presente estudo: após a prática do esporte, um voluntário poderá secar a transpiração de sua cabeça, que poderá levar à remoção de parte da caspa formada. A variação de caspa sazonal, determinada em condições restritas, confirmou que a quantidade de capa gerada durante o inverno foi de, aproximadamente, o dobro da gerada no verão. Como foi fixado um intervalo constante após cada lavagem de cabelo, a variação sazonal acima não foi causada pela mudança sazonal da frequência da lavagem do cabelo. 

Os autores assumiram que a variação sazonal observada foi causada pela mudança sazonal no ressecamento do couro cabeludo, mas não pela variação da frequência de lavagem. Kumagai et al, nossos colaboradores, mostraram que os valores de PAT (perda de água transepidérmica) eram elevados no inverno, comparados com os valores no verão (Figura 3); a saber, demostraram que a pele fica mais seca no inverno.¹⁶ Por esta razão, considerou-se necessário adicionar uma propriedade hidratante ou umectante como atividade farmacológica básica no desenvolvimento de todo produto anticaspa. 

• Relação entre a quantidade de caspa e o tempo de renovação do estrato córneo. Apesar de se considerar que a geração intensa de caspa significa diminuição no tempo de renovação do estrato córneo, resultando em muita descamação, esta associação ainda permanece sem provas devido aos insuficientes resultados de testes acumulados. Neste contexto, nossos experimentos objetivaram investigar as possíveis relações entre a quantidade de caspa gerada e o tempo de renovação do estrato córneo. 

Primeiramente a quantidade de caspa foi medida em relação ao número de células que sofreram paraqueratose. O número de núcleos nas células diminui até aproximadamente zero durante o processo de divisão celular e, com o tempo são finalmente descartadas através da descamação. Entretanto, quando a taxa de renovação é suficientemente rápida, a descamação ocorre como relatado, antes de desaparecimento dos núcleos, permitindo que os núcleos permaneçam como núcleos observáveis. A contagem das células queratinosas que ainda possuem os seus núcleos, é denominado o número de células paraqueratóticas. 

Após medir a quantidade da caspa pelo método gravimétrico, amostras de caspa foram marcadas com uma mistura de azul de metileno e rodamina B (1:1) e foi determinado o número de células de inclusão nuclear¹⁷ (Figura 4).

O coeficiente de correlação para a quantidade de caspa e de células paraqueratóticas foi encontrado como sendo 0,77, uma boa correlação. Como o número de células paraqueratóticas está associado ao tempo de renovação para o extrato córneo, foi estudada a relação da quantidade de caspa com o tempo de renovação (Figura 5). 

Após selecionar 10 voluntários que apresentavam grandes quantidades de caspa e 10 voluntários que apresentavam pequenas quantidades de caspa, foram medidos os tempos de renovação para o estrato córneo do couro cabeludo. Foram escolhidos os locais de medida, os pontos à direita e à esquerda em posições simétricas, e foi efetuada a medida pelo método de cloreto de dansila. O tempo médio de renovação do estrato córneo do couro cabeludo foi de 15,3 para aqueles voluntários com considerável geração e 17,1 com pequena geração de caspa, proporcionando diferença estatisticamente significativa entre os grupos. Por outro lado, o tempo de renovação do local de controle, a pele da fronte, não apresentou qualquer diferença significativa. 

Com isto, confirmou-se a suposição geralmente aceita de que a geração abundante de caspa está associada ao tempo de renovação intensificado. 

A partir de definição acima, a normalização do tempo de renovação para o estrato córneo foi reivindicada como a segunda atividade básica farmacológica requerida para um novo produto anticaspa. 

• Pesquisa da causa da aceleração do tempo de renovação do estrato córneo. No item anterior foi feita menção de que os voluntários com geração de caspa aumentada apresentaram renovação intensificada do extrato córneo do couro cabeludo. Neste item será discutido qual substância aumenta a taxa de renovação. 

A pele geralmente secreta sebo; triglicéride, constituinte principal do sebo, conhecido por ser hidrolisado na pele e convertido em ácidos graxos livros. Numerosos artigos foram publicados relatando a ação dos ácidos graxos na pele.¹⁸ Entretanto, em todos estes estudos foi efetuada pesquisa usando-se ácidos graxos livres em altas concentrações; por este motivo, os resultados obtidos não reproduziram verdadeiramente as condições reais. Este capítulo pretende, portanto, relatar a influência dos níveis fisiológicos de um ácido graxo sobre a pele por aplicação tópica. 

O procedimento incluiu aplicação do ácido oléico, o constituinte mais abundante do sebo humano, na pele abdominal de 3 homens adultos saudáveis. No local de teste, 2 cm de diâmetro, foi aplicado 0,8 μg de ácido oléico em solução de 20 μl de etanol una vez ao dia, 4 vezes no total e, sub sequentemente, medido o tempo de renovação do estrato córneo, usando-se cloreto de dansila. 

Quando o estado da pele era normal, o tempo de renovação para o estrato córneo do local de teste abdominal não foi muito diferente daquele do local de controle (onde foi aplicada somente solução de etanol). Pelo contrário, quando o ácido oléico foi aplicado sobre a pele preparada (sem gordura e áspera), previamente tratada com acetona/éter por um minuto uma vez ao dia, 4 vezes no total, a taxa de renovação mostrou-se intensificada, se comparada com o controle (Figura 6). 

Com isto, confirmou se que, enquanto os ácidos graxos livres, representados pelo ácido oléico, não exercem qualquer influência na sua concentração fisiológica, este tipo de substância pode influenciar a pele preparada (com a retirada a gordura e áspera), ao acelerar a renovação do estrato córneo. A partir do que foi determinado, então, a terceira atividade básica farmacológica requerida de uma nova preparação anticaspa: propriedade de inibir a formação de ácidos graxos livres, a partir de triglicérides. 

Em seguida, foi efetuada a medida da influência dos peróxidos lipídicos na pele. 

A Figura 7 mostra as quantidades medidas de peróxidos lipídicos através do método TBA na amostra da caspa. Foram encontradas proporções maiores em voluntários com mais caspa. Isto indicou a existência de uma correlação entre a quantidade de peróxido lipídico contida na caspa. 

A Figura 8 indica as quantidades medidas de peróxidos lipídicos no couro cabeludo e na caspa no 1° e 3° dia após a lavagem do cabelo. Enquanto a quantidade de peróxidos lipídicos no couro cabeludo no apresentou aumento, mesmo no 3° dia, aqueles na caspa apresentaram aumento de, aproximadamente, 4,5 vezes. Deste resultado assumiu-se que, enquanto o fator de formação inibição de peróxido foi confirmado como sendo ativo na pele como parte de um mecanismo biológico de prevenção, não existe um fator deste tipo na caspa. 

A etapa seguinte foi para pesquisar a influência destes peróxidos lipídicos sobre o couro cabeludo no crescimento da caspa. 

Como peróxido lipídico a ser usado no abdómen humano foi selecionado o hidroperóxido de esqualeno, mais suscetível à peroxidação e o constituinte mais abundante do couro cabeludo. O hidroperóxido de esqualeno utilizado foi preparado pelo aquecimento oxidativo do esqualeno e, a concentração selecionada, a mesma do nível fisiológico usado no experimento de ácido graxo livre (Figura 9). 

As 4 aplicações repetidas de 20 μg de hidroperóxido de esqualeno no local do teste, de 2 cm de diâmetro, na pele normal de 3 homens adultos não forneceram quaisquer diferenças em relação ao controle (um ponto aplicado com álcool) quanto ao tempo de renovação do estrato córneo. Por outro lado, a aplicação do mesmo peróxido sobre um local da pele preparado (sem gordura, eliminada com acetona/ éter e áspero) produziu claramente taxas de renovação melhoradas. 

Portanto, a quarta atividade farmacológica básica da nova preparação anticaspa deveria ser una propriedade antioxidante, uma ação inibitória contra a formação de peróxidos lipídicos. 

Após a aplicação destas substancias sobre a pele abdominal humana, não puderam ser visualmente detectadas reações irritantes como eritema. Observou-se, entretanto, que a taxa de renovação, apesar de não variar na pele normal, aumentou na pele, intencionalmente, tornada áspera e sem gorduras.

Por este motivo considerou-se que, enquanto os ácidos graxos livres e os peróxidos lipídicos se inativam, na pele, também podem melhorar a renovação do estrato córneo, levando a geração exacerbada de caspa na pele áspera e sem gordura. 

Leia também Parte II - Desenvolvimento de Novo Ativo

 

Este artigo foi publicado na revista Cosmetics & Toiletries (Edição em Português), 5(5): 48-54, 1993.