Desenvolvimento de formulações tópicas antioxidantes

Efeito da radiação UV sobre a pele
Antioxidantes tópicos
Estrutura da pele e estudos de liberação e permeação/retenção cutânea
Considerações finais
 

Nos últimos tempos tem-se relacionado o envolvimento de radicais livres em muitas patologias que acometem os seres humanos. Entre elas, aquelas desenvolvidas na pele, como envelhecimento precoce e câncer, entre outras. Desta forma, é possível observar na área científica uma extensa preocupação na tentativa de elucidar a formação destes radicais, como também de desenvolver mecanismos para prevenir e/ou tratar os danos que estas espécies químicas causam à saúde humana.

Sabe-se que os radicais livres são continuamente produzidos em pequenas quantidades durante o metabolismo celular, como na produção de energia, fagocitose, controle do crescimento celular e síntese de compostos biologicamente importantes. Em sistemas biológicos, os radicais livres são, em geral, derivados do oxigênio molecular diatômico (O₂) e são comumente denominadas espécies reativas de oxigênio (EROS), como, por exemplo, o ânion radical superóxido (O₂^-·), o radical hidroxila (HO·), peroxila (RO₂·) e o óxido nítrico (NO·). Outros oxidantes, como o peróxido de hidrogênio (H₂O₂), oxigênio singlete (¹O₂) e o peróxi-nitrito (OHOO^-) etc., apesar de não serem, podem facilmente sofrer reações e formar radicais livres, sendo também denominados EROS.¹

Por definição, as EROS são espécies capazes de existir independentemente, que contêm um ou mais pares de elétrons não-emparelhados. Desta forma, uma vez formada, essas espécies químicas podem reagir com biomoléculas por várias interações, principalmente com lipídios, como os ácidos graxos poliinsaturados das membranas, levando a várias alterações bioquímicas.

No entanto, para tentar proteger os tecidos contra os possíveis danos provocados pelas EROS liberadas, o organismo possui mecanismos antioxidantes endógenos, como superóxido dismutase (SOD), catalase, vitamina C, vitamina E, ubiquinonas, ácido úrico, glutationa, transferrina, entre outros. Esses mecanismos de defesa são suficientes para manter a homeostasia de todos os tecidos, mas, em algumas situações, como na exposição à radiação UV, ao calor e em algumas patologias, uma condição de estresse oxidante pode se estabelecer. Nesses casos, pode ocorrer excesso de EROS formadas, depleção de antioxidantes endógenos ou ainda a associação destas alterações.

A pele é um órgão complexo e o maior do corpo, responsável por numerosas funções fisiológicas e imunológicas, e está exposta a elevado estresse oxidante, no qual poucos tecidos estão sujeitos. Esse alto nível de estresse oxidante é causado por fontes endógenas e exógenas, pois a pele está exposta tanto ao O₂, fornecido pela circulação sanguínea quanto ao O₂ proveniente do meio ambiente, que se encontra em maiores concentrações do que nos outros órgãos. Além disso, a pele também está sujeita à ativação do O₂ pela radiação UV.^2,3

Efeito da radiação UV sobre a pele

Os raios UV que atingem a Terra são responsáveis por vários efeitos nocivos nos indivíduos, a curto e médio prazos, como a perda de água e o ressecamento da pele, provocando aspecto opaco, perda da elasticidade, eritema, descamação e manchas. Podem ocorrer ainda queimaduras solares de diferentes graus, induzidas pela radiação UVB. A exposição crônica da pele à radiação UV também leva à variedade de efeitos adversos, incluindo fotoenvelhecimento (enrugamento, elastose solar e irregularidade da pigmentação), carcinoma de células basais e escamosas, melanoma maligno da pele e diminuição da imunidade.

Essas alterações do tecido cutâneo, causadas pela exposição aguda ou crônica à radiação UV, podem ser originadas devido à diminuição de antioxidantes presentes na pele, à formação exacerbada de EROS, ao aumento dos produtos da peroxidação lipídica,⁴ à superexpressão das metaloproteinaeses de matriz (MMP)⁵ e às alterações nos processos de sinalização celular que controlam a diferenciação e o ciclo celular causando prejuízos ao DNA.⁶

O grau de risco das alterações citadas anteriormente está relacionado ao tipo de raio UV e à intensidade que os indivíduos se expõem à radiação UV, além de tam bém estar relacionado à quantidade de “manto  protetor” de melanina da pele que absorve a luz UV, sendo que esta característica é particular para cada indivíduo. Com relação à radiação UV, sabe-se que cerca de 10% da radiação UVB que incide na Terra é capaz de penetrar na epiderme e atingir a derme, enquanto que para a radiação UVA este índice é de 20%.¹ Assim, devido a maior presença da radiação UVA no espectro de radiação UV e a sua maior habilidade em penetrar profundamente na derme, faz com que esta irradiação tenha maior contribuição nas alterações de pele.

No nível molecular, as radiações UVA e UVB diferem em seus sítios de ação na geração de lesões nas biomoléculas presentes na pele. A radiação UVB é absorvida diretamente pelo DNA celular, enquanto a UVA é absorvida por cromóforos intracelulares, como a riboflavina e enzimas presentes na membrana. Isso resulta numa alteração do potencial redox da célula pela geração de espécies reativas de oxigênio e/ou óxido nítrico causando fotossensibilização.⁷ Além disso, a radiação UVA estimula a expressão de uma variedade de genes envolvidos na resposta do estresse celular e em caminhos de transdução de sinal. Dessa maneira, a exposição à radiação UVA pode, por exemplo, induzir a síntese de várias metaloproteinases de matriz (MMP), causando o mau funcionamento do processo de remodelação do tecido conectivo. As MMP são uma família de endoproteinases zinco-dependentes que possuem papel importante na remodelação dinâmica da matriz extracelular,⁵ tendo como alvo o colágeno, laminina, fibronectina e proteoglianca. A MMP-1, a colagenase intersticial, é responsável pela degradação do colágeno da derme e o aumento da sua atividade é observado principalmente em progressões de tumores, metástase e, também, no fotoenvelhecimento cutâneo da pele humana.⁸

Antioxidantes tópicos

Devido às descobertas do envolvimento da radiação solar com o envelhecimento precoce e os danos nocivos à pele, nos últimos tempos tem surgido intensa preocupação na prevenção e/ou tratamento dos distúrbios de pele. Mecanismos de prevenção aos danos da radiação UV na pele têm sido propostos e incluem ações de prevenção primária por meio de proteção contra luz solar (como o uso de protetores solares), efetivas e de baixo custo. Outra estratégia, internacionalmente aceita, é a educação em saúde, tanto para profissionais quanto para a população em geral.

Entretanto, a estratégia de grande interesse, para tentar minimizar os danos da radiação UV à homeostasia celular da pele, é a utilização tópica de substâncias antioxidantes. Assim, a utilização destas formulações antioxidantes tem sido descrita na literatura e existem evidências que estas podem proteger e possivelmente corrigir os prejuízos provocados por radiação UV na pele,⁹ além de fornecer proteção contra o eritema e a citotoxicidade.¹⁰ Um composto pode exercer atividade antioxidante in vivo inibindo a geração de EROS, seqüestrando radicais livres diretamente ou, ainda, elevando o nível de antioxidantes endógenos (estimulando a expressão de genes que codificam a superóxido dismutase, catalase etc). A ação fisiológica de muitos antioxidantes está estabelecida e a importância relativa desses antioxidantes in vivo depende de qual EROS é gerada, como e onde é gerada, e qual o alvo biológico. Desse modo, é possível que um antioxidante proteja em um sistema e falhe em outro ou até mesmo cause algum dano.¹¹

Os danos causados à pele pela radiação UV ocorrem rapidamente. Portanto, para que um antioxidante exerça seu papel, é necessário que esteja em concentração adequada no início e durante o estresse oxidante.¹² Entretanto, após a exposição crônica ou excessiva à radiação UV, os antioxidantes de baixo peso molecular, bem como os enzimáticos, podem ser diretamente consumidos ou inativados pela radiação solar e pelas EROS.¹³

Desta forma, tem-se sugerido que ampla variedade de compostos atue como antioxidantes in vivo, como a vitamina E, ácido ascórbico, â-caroteno e compostos fenólicos,¹¹ entre outros (Figura 1). Entre estes compostos citados, a vitamina E tem demonstrado ser um antioxidante importante, atuando como potente seqüestrador de diversos radicais livres.¹⁴ Além disso, por ser o antioxidante lipofílico de origem endógena mais encontrado em tecidos, é uma escolha adequada para ser aplicado topicamente para aumentar a proteção antioxidante da pele.

No entanto, uma classe de compostos que também merece destacado interesse é a dos compostos fenólicos e seu subgrupo, os flavonóides,¹⁵ largamente encontrados em plantas e seus derivados.¹⁶ Assim, nos últimos tempos, pode ser observado aumento da demanda pelo consumidor pela utilização de plantas, bem como de seus extratos. Este elevado interesse está também relacionado à tendência no uso de produtos de origem natural, bem como à atenção dada à dieta contendo esta classe de substâncias naturais que protegem contra danos na pele.¹⁷

Um flavonóide de grande interesse atual é a qüercetina, pois têm apresentado potente atividade antioxidante in vitro.^18,19 Há estudos também in vivo demonstrando que quando a quercetina é aplicada topicamente, é capaz de proteger a pele contra os danos causados pela radiação UVB, diminuindo o processo inflamatório, protegendo o antioxidante endógeno GSH e diminuindo a secreção de MMP.²⁰ Sendo assim, extratos naturais, que contêm compostos fenólicos e flavonóides em sua composição e que têm grande uso na medicina popular, têm apresentado atividade antioxidante e são considerados fortes candidatos à serem utilizados em formulações tópicas para prevenção e/ou tratamento dos danos causados pelas EROS à pele. Muitos extratos, incorporados ou não em formulações, como própolis,²¹ Ginkgo biloba, Glycyrrhiza glaba,²² Isoflavin Beta,¹⁹ entre outros, foram avaliados e demonstraram seqüestrar diversas EROS.

Estrutura da pele e estudos de liberação e permeação/retenção cutânea

Em geral, quando uma formulação tópica, antioxidante ou não, é aplicada na superfície da pele, algum resultado específico é desejado e, dependendo do objetivo e do mecanismo de ação, será necessário que as substâncias ativas presentes nesta formulação alcancem camadas específicas na pele. Além disso, outro requisito também é normalmente necessário: impedir altas concentrações sanguíneas da substância ativa, isto é necessário não só devido a efeitos sistêmicos não desejados, mas também devido à rápida remoção pelo sangue, o que pode limitar a baixa concentração da substância no tecido alvo. Assim, durante o desenvolvimento de uma formulação tópica adicionada de uma substância antioxidante exige o conhecimento da penetração/retenção (na pele) desta substância ativa, além de sua possível absorção pela circulação sanguínea. Porém, a previsão quantitativa da taxa e da extensão da penetração cutânea de substâncias ativas aplicadas topicamente é complexa devido à variabilidade da pele de mamíferos e das características de cada substância ativa.

A pele é um órgão muito dinâmico e formado por camadas de células com diferentes propriedades (Figura 2). Dentre a variedade de funções biológicas que a pele apresenta, a mais marcante é sua função de barreira, de primeira relevância para a absorção cutânea.²³

A principal resistência à permeação/penetração da maioria das substâncias antioxidantes, porém não de todas, reside na fina camada superior da pele, o estrato córneo, formada por uma camada compacta de células (corneócitos) alongadas, mortas e desidratadas. No interior dos corneócitos são encontradas substâncias hidrofílicas de baixa massa molecular, como aminoácidos e açúcares como também a queratina, que fornece resistência a estas células. Entre estes corneócitos está presente a maioria do material lipídico na forma de lipídios neutros. Assim, este tecido apresenta domínios lipídicos e hidrofílicos nos quais a substância antioxidante aplicada sobre a pele precisa se difundir para alcançar os seus tecidos viáveis mais internos.²⁴

Abaixo do estrato córneo está a epiderme viável, enzimaticamente ativa e formada por células em vários estágios de diferenciação bioquímica. Na epiderme há um constante movimento das células recém-formadas, partindo da camada basal em direção ao estrato córneo, sendo que a taxa deste processo de renovação celular é igual à taxa de desprendimento das células mais externas do estrato córneo.²⁴

A epiderme também possui algumas estruturas, como os folículos pilosos e as glândulas sebáceas; porém, neste tecido não existem vasos sanguíneos, e os nutrientes necessários precisam se difundir partindo da derme. A derme é uma camada mais espessa constituída por muitas fibras e é o tecido responsável pela maioria da força mecânica e das sensações da pele.²⁴

Assim, para o desenvolvimento de uma formulação antioxidante tópica, faz-se necessário o conhecimento das propriedades físico-químicas, como coeficiente de partição, coeficiente de difusão, solubilidade, massa molecular etc. das substâncias antioxidantes utilizadas, para avaliar sua capacidade de penetrar na pele ou através dela. Além disso, a avaliação da composição da formulação tópica também é muito importante, pois os seus componentes podem influenciar diretamente a taxa na qual a substância antioxidante atravessa a pele. Esta influência está relacionada à capacidade da formulação em solubilizar a substância antioxidante, disponibilizando-a para ser liberada, bem como está relacionada à sua capacidade de desestruturar a barreira da pele, pois pode apresentar componentes que atuam como promotores da permeação cutânea.²⁶

Desta maneira, o desenvolvimento de uma formulação antioxidante é muito complexo, pois há vários parâmetros que podem influenciar na performance do antioxidante quando aplicado à pele. O conhecimento destes parâmetros irá permitir o desenvolvimento de formulações ideais; porém, somente o estudo clínico posterior demonstrará se o objetivo proposto para a formulação foi atingido.

Os testes clínicos, que demonstram a eficácia de produtos para tratamento de pele, podem ser processos caros e que podem levar muito tempo. Assim, é possível trocar alguns destes testes clínicos, durante o desenvolvimento de produtos, por testes laboratoriais que se relacionam com o resultado clínico. Estudos in vitro em que são utilizadas células de difusão, como células de Franz (Figura 3), são atualmente muito utilizados. Estes testes permitem criar condições nas quais a difusão de uma substância ativa através de uma barreira pode ser medida, podendo ser esta uma membrana sintética ou mesmo a pele.

Inicialmente, é realizado um estudo de liberação, pois a substância antioxidante deve ser liberada do carreador (veículo) quando estiver em contato com a superfície epidérmica e, então, estará disponível para penetrar no estrato córneo e nas camadas inferiores da pele. Estes estudos de liberação in vitro podem servir como uma importante ferramenta para a avaliação inicial de formulações experimentais e também para avaliar a biodisponibilidade.²⁷ Nestes estudos, normalmente, são utilizadas membranas sintéticas, que são barreiras porosas funcionando como barreiras de difusão passiva onde a taxa de difusão é determinada pela concentração do soluto.²⁸ Uma amostra da formulação, contendo a substância antioxidante, é adicionada no compartimento doador sobre a membrana, e esta substância é avaliada na solução receptora que está em contato com a porção inferior desta membrana.^29,30

Após estudos de liberação é necessário avaliar a penetração de substâncias antioxidantes na ou através da pele. Estes estudos são em geral realizados utilizando pele de camundongo, pele humana proveniente de cirurgia ou pele de orelha de porco, que é considerado o melhor modelo de pele, pois além de sua maior disponibilidade, tem demonstrado propriedades histológicas e fisiológicas similares à da pele humana.²⁸

Na área cosmética, absorção na ou através da pele é de grande importância, pois, em geral, os componentes de cosméticos não devem ter absorção cutânea e sim ter efeito na ou próximo da superfície da pele.³⁰ Porém, as substâncias ativas de produtos antienvelhecimento (como os antioxidantes) e hidratantes têm que atingir o estrato córneo e a epiderme para exercer seu efeito.³¹ Portanto, para estes tipos de produtos, estudos de permeação/ retenção cutânea in vitro são úteis e permitem avaliar diferentes substâncias ativas, além de permitir a comparação de formulações. Em muitos casos, somente resultados comparativos são necessários.³²

Para a realização dos estudos de liberação e permeação/retenção cutânea de uma formulação, a substância ativa é quantificada por metodologia analítica adequada tanto na solução receptora quanto na pele que sofreu permeação para a quantificação da retenção da substância. Na maioria das vezes a quantidade de substância ativa detectada é muito pequena e, desta forma, somente métodos analíticos muito sensíveis como CLAE (cromatografia líquida de auto-eficiência) e radioimuno-ensaios são utilizados. No caso da utilização de um extrato natural, como substância ativa, numa formulação antioxidante cosmética, é escolhido um ou mais marcadores que sejam componentes majoritários no extrato para serem avaliados. Porém, ao trabalharmos com extratos naturais, algumas dificuldades relacionadas a estes estudos podem surgir. Por um lado, a tarefa de se estabelecer um marcador pode ser dificultada pela grande gama de componentes ativos presentes no extrato que podem variar enormemente dependendo da região e da época de coleta da planta. Por outro, a avaliação do conteúdo de somente 1 ou 2 marcadores pode não representar fielmente a atividade biológica total do extrato, pois sabe-se que os diferentes componentes dos extratos podem ter ação antioxidante sinérgica.

Uma estratégia para tentar solucionar estes problemas poderia ser a avaliação adicional da ação biológica, como a atividade antioxidante. Assim, para realizar estudos de liberação e permeação/retenção cutânea durante o desenvolvimento de uma formulação antioxidante tópica adicionada de extrato natural, seria de grande valia avaliar, além do(s) marcador(es), também a atividade antioxidante liberada e/ou permeada/retida na pele. Existem, atualmente, vários métodos de determinação da atividade antioxidante que podem ser utilizados nestes estudos, como o seqüestro do radical DPPH, inibição da peroxidação lipídica, inibição da quimioluminescência, entre outros.³³ Entre estes métodos, a inibição da quimioluminescência demonstrou resultados muito satisfatórios em estudos de liberação³⁴ e permeação/retenção cutânea realizados com formulações tópicas adicionadas com extrato de própolis. No estudo de liberação, além de determinar a atividade antioxidante por quimioluminescência, também foi avaliado um marcador e os resultados demonstraram que estes estudos em paralelo permitem melhor avaliação da liberação dos ativos presentes nos extratos incorporados na formulação tópica.

,Considerações finais

Como já mencionado, a pele é o tecido de nosso corpo mais exposto ao estresse oxidante, devido tanto a fatores internos como externos. No entanto, nos últimos tempos, grande atenção tem sido direcionada a um fator principal: a radiação UV que tem a capacidade de causar inúmeras patologias, além do envelhecimento deste tecido.

Assim, mecanismos para prevenir os danos da radiação UV na pele têm sido implantados e incluem proteção contra luz solar (como o uso de protetores solares), educação em saúde e uma estratégia de grande interesse, que é a utilização tópica de substâncias antioxidantes. Assim, o antioxidante exógeno seria capaz de seqüestrar as EROS geradas na exposição à radiação UV, restabelecendo o equilíbrio pró-oxidante/antioxidante no organismo e evitaria o desencadeamento das alterações bioquímicas citadas anteriormente.

Esta preocupação em utilizar antioxidantes tópicos tem levado à realização de muitos estudos sobre esse assunto. No entanto, para o desenvolvimento de formulações tópicas antioxidantes eficazes, principalmente quando é utilizado extrato natural, há a necessidade da realização de muitos estudos que exigem o conhecimento pormenorizado do antioxidante a ser utilizado, bem como da formulação onde este antioxidante será incorporado.

Agradecimentos
Os autores agradecem a CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo apoio financeiro.

Franciane Marquele de Oliveira é aluna de doutorado na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP) da Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP.

Yris Maria Fonseca é aluna de mestrado na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP) da Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP.

Maria José Vieira Fonseca é professora livre-docente da disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e Cosméticos da FCFRP-USP, Ribeirão Preto, SP.

Este artigo foi publicado na revista Cosmetics & Toiletries Brasil, 20(4): 64-68, 2008