Antioxidantes vegetais: Papel Protetor Contra Espécies Reativas de Oxigênio 

Formação de RL em Sistemas Biológicos
Antioxidantes de Ceras de Folhas
Antioxidantes de Grãos e Sementes
Ervas e Drogas em Estado Bruto 
Um Novo Antioxidante
Conclusão

Acredita-se que a produção excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS), tais como o peróxido de hidrogênio, o Ânion superóxido, o radical hidroxila e outros radicais livres, cause dano às células. No entanto, a maioria dos organismos vivos tem, em suas células, sistemas extremamente eficientes de defesa e proteção, que são essenciais para defendê-los contra o estresse oxidativo causado pelas ROS. Tais sistemas incluem a inativação enzimática, bem como a proteção não enzimática. Publicações recentes relatam mujas indicações de que os antioxidantes endógenos devem desempenhar um importante papel nos mecanismos de defesa antioxidante do sistema biológico. Supõe-se que o dano oxidativo aos componentes da célula seja um dos vários fatores causais de muitas doenças, inclusive do envelhecimento.

Já foram encontrados compostos antioxidantes em numerosos ingredientes vegetais, embora as propriedades químicas e os papéis fisiológicos dos princípios ativos ainda não tenham sido plenamente entendidos. Sementes oleosas, grãos, legumes, frutas, folhas e cera de folhas, casca e raízes, especiarias, ervas e drogas em estado bruto são importantes fontes de antioxidantes naturais. Procedemos, em laboratório, ao isolamento e identificação de antioxidantes vegetais de ceras de folhas e casca de semente de arroz. Este artigo enfoca o desenvolvimento e a utilização de antioxidantes naturais, do ponto de vista da atividade biológica e da funcionalidade.

Formação de RL em Sistemas Biológicos 

O oxigênio, como radical binário de valência tripla (³O₂,),presente na atmosfera pode, pela redução de quatro elétrons, produzir o ânion superóxido (O^-₂), radical hidroxila (^-OH), peróxido de hidrogênio (H₂O₂), e finalmente H₂O (Figura 1). O oxigênio singlete (¹O₂) é formado de estados excitados de vários sensibilizadores, como clorofila, acridina e outros pigmentos. Entre os principais alvos celulares e extracelulares dessas ROS estão as proteínas, as enzimas e o ADN/ARN. No entanto, importantes alvos primários do dano oxidativo provavelmente são os componentes de ácido graxo insaturado das membranas celulares.¹

A peroxidação lipídica é um problema não apenas na indústria, mas também no corpo humano. A produção excessiva das ROS, particularmente radicais hidroxila, pode facilmente de desencadear a peroxidação de lipídios nas membranas celulares, formando peróxidos lipídicos. Muitos pesquisadores provaram que os peróxidos lipídicos e as ROS, que dão início à produção de peróxidos lipídicos, estão intimamente relacionados a uma série de doenças (incluindo o câncer), além de acelerarem o envelhecimento. Sabe-se que a peroxidação de lipídios é uma reação em cadeia de RL, que ocorre in vivo e in vitro. As reações formam muitos produtos secundários, tais como alcanos, álcoois, ácidos e carbonilas. Muitos desses produtos secundários, principalmente o malondialdeído (MDA) e o 4-hidroxinonenal (4-HN) são, em si, altamente reativos. Foi demonstrado que eles interagem com componentes, biológicos como proteínas, aminoácidos, aminas e ADN.

Há muitos relatos sobre a química e a atividade biológica do MDA. Acredita-se que o MDA seja formado tanto não enzimática como enzimaticamente, como um produto de decomposição da peroxidação lipídica. O MDA, que se demonstrou ter importância biológica, pode estar envolvido no envelhecimento, na mutagênese e na carcinogênese. 

Antioxidantes de Ceras de Folhas 

A estabilidade do óleo de Eucalyptus contra a degradação oxidativa pode ser devida à presença de um sistema protetor nas ceras de folhas, uma proteção não apenas física, mas também química. A seleção entre 76 ceras de folhas encontrou uma forte atividade antioxidante nas ceras de folhas extraídas das espécies Eucalyptus e Prunus. Mais da metade dos extratos brutos de clorofórmio em 17 diferentes ceras de folha de Eucalyptus mostraram atividade antioxidante bastante forte num sistema modelo usando ácido linoléico como substrato. A atividade antioxidante foi determinada por métodos de tiocianato. Usando isolamento e identificação em larga escala de substâncias antioxidantes nas ceras de folha de Eucalyptus, identificamos dois componentes ativos, 7-tritriacontano-16,18-diona e 4-hidroxi-tritriacontano-16,18-diona (Figura 2). O estudo das relações estrutura atividade dos análogos de β dicetona indicaram que as cadeias laterais longas de hidrocarboneto nos dois lados das β-dicetonas parecem ser essenciais na atividade antioxidante. A forma enol de uma das metades da β-dicetona parece ser essencial, bem como a cadeia de hidrocarboneto lipofílico da outra metade, para a atividade de eliminação de radicais livres.² Recentemente, Hirose et al³ relataram que o n-triticontano-16,18-diona inibia fortemente a carcinogênese no fígado e pâncreas de ratos, embora os detalhes do mecanismo não estejam claros. Relatou-se que as β-dicetonas estão presentes como um dos principais componentes das ceras de folhas de plantas comuns tais como a acácia, o rododendro, a cevada e a aveia.⁴

Durante nossa investigação de antioxidantes nos extratos de clorofórmio de cera de folha da espécie Prunus, pareceu que a folha de Prunus grayana Maxim continha antioxidantes diferentes dos tocoferóis. Sua purificação em larga escala levou-nos a isolar vários conjugados de tocoferol: dois novos derivados, com tocoferol substituído por fenilpropanóide, denominados prunosol A e B; e três dímeros de tocoferol.⁵ Esses conjugados de tocoferol não foram relatados anteriormente como componentes endógenos dessa cera de folha. A análise par HPLC desses conjugados de tocoferol na cera de folha não refinada de Prunus grayana Maxim constatou que os dimeros de tocoferol estão presentes em grande quantidade. Até hoje, não houve proposta para o uso desses conjugados de tocoferol, embora esperemos que sejam encontradas aplicações antioxidantes para esses novos conjugados.

Antioxidantes de Grãos e Sementes

O arroz (Oryza sativa Linn) é o principal cereal alimentício da Ásia e o alimento básico de quase metade da população do mundo. Recentemente, os autores investigaram os potenciais de germinação de sementes de arroz armazenadas durante muito tempo. A diferença entre as variedades de sementes de arroz japônica e índica, em razão do envelhecimento, poderia refletir diferenças na eficácia dos sistemas de defesa da casca do arroz. Até agora, acreditava-se que isso oferecesse apenas proteção física ao grão de arroz. No entanto, quando as sementes de arroz japônica e índica foram armazenadas à temperatura ambiente, constatou-se que as sementes do arroz índica conservaram viabilidade, mesmo depois de um ano de armazenamento (vida longa), enquanto a maioria das sementes do arroz japônica perdia a viabilidade depois de um ano de armazenamento à mesma temperatura (vida curta). 

Foram usados modelos experimentais para estudar o envelhecimento acelerado por peroxidação lipídica induzida por radicais hidroxila gerados durante irradiação γ do sistema biológico. Esses estudos indicaram que a fração da casca das sementes de arroz de longa vida deve ter constituintes antioxidantes.⁶ Foi constatado que os componentes ativos são substâncias flavonoides. Uma delas, possuidora de propriedade antioxidante tão intensa quanto a do α-tocoferol, foi identificada como isovitexina, um flavonoide C-glicosil (Figura 3). Estão em curso investigações adicionais sobre os detalhes dos mecanismos de proteção contra danos oxidativos desses antioxidantes plenos.

Os autores isolaram e identificaram pigmentos antioxidantes do arroz integral, pois as sementes do arroz integral conservam a viabilidade mesmo depois de muito tempo de armazenamento, enquanto as sementes do arroz branco perdem- na em pouco tempo. Usando técnicas de purificação e isolamento em larga escala, foi constatado que a cianidina-3-O-β-D-glucopiranosida possui forte atividade antioxidante em meio ácido. O cianidina-3-O-β-D-glucopiranosídeo também foi identificado como o pigmento antioxidante nos feijões preto e vermelho. A relação entre a variedade e o teor desses pigmentos antioxidantes nos grãos e feijões está sendo estudada.⁸

Recentemente, os autores conseguiram isolar os componentes antioxidantes com folhas jovens de cevada. A 2"-O-glucosil-isovitexina foi identificada como um composto  antioxidante peculiar.⁹ Recentes relatos indicam que o 2"-O-glucosil-isovitexina tem atividade antioxidante bastante forte num sistema modelo usando éster metílico do ácido linoléico como substrato, peroxidação induzida por reação de Fenton (Fe⁺⁺/H₂O₂).¹⁰ Mais recentemente, foi constatado que a 2"-O-glucosil-isovitexina mostra atividade protetora contra a peroxidação lipídica do esqualano, induzida por radiação UVB.¹¹ Atualmente, estão em andamento tentativas de encontrar usos para esse antioxidante.

Ervas e Drogas em Estado Bruto 

Foram extensamente estudados os efeitos farmacológicos das ervas e de drogas em estado bruto preparadas com materiais vegetais. No entanto, há apenas alguns relatos disponíveis sobre os componentes antioxidantes das ervas e das drogas em estado bruto. Começamos a esquadrinhar 32 ervas e drogas em estado bruto obtidas em mercados populares e farmácias de Taipei. Dessas, 22 espécies mostraram atividade antioxidante bastante intensa. Naturalmente, parece que a vitamina E é um dos mais importantes antioxidantes, podendo ser responsável pela atividade antioxidante dos extratos de ervas e drogas em estado bruto. Os derivados de tocoferol foram quantificados por HPLC. 

A planta inteira da Osbeckia chinensis é, há muito tempo, usada comumente como analgésico, anti-inflamatório e antipirético na Tailândia, no Japão e na China. No entanto, constatou-se que a Osbeckia chinensis não tem nenhum tocoferol, diferentemente de outras ervas e drogas em estado bruto, que têm tocoferóis como componentes antioxidantes. Esses resultados nos incitaram a isolar e identificar os princípios ativos dos extratos de Osbeckia chinensis.¹² Depois da purificação em larga escala, muitos componentes antioxidantes diferentes foram isolados e identificados. A maior parte da atividade antioxidante dos extratos de Osbeckia chinensis parece ser devida a antioxidantes tipo tanino, em particular 4 casuarinina (Figura 3). Esses taninos contêm em sua estrutura uma cadeia de ácido elágico que por si, tem uma atividade antioxidante semelhante.¹³ O ácido elágico pode ser obtido como subproduto na indústria de produção de polpa de lascas da madeira Eucalyptus. No entanto, não teve nenhum emprego até hoje.

Recentemente, Nakatami et al¹⁴ relataram o isolamento e a determinação da estrutura de diterpenoides antioxidantes solúveis em lipídios, de especiarias que pertencem à família das Labiatae, tais como o alecrim e a sálvia (Figura 4). 

As sementes e os óleos de gergelim (ou sésamo) são tradicionalmente usados no Japão, na China, na Coréia e em outros países do oriente. Os óleos de gergelim, em especial os óleos de gergelim torrado, são amplamente usados em pratos chineses e japoneses, e avaliados como altamente antioxidantes. As sementes de gergelim também mostram boa atividade de germinação mesmo depois de longo armazenamento. No entanto, quais constituintes químicos seriam responsáveis por sua integridade e atividade antioxidante é algo que ainda não foi claramente determinado. 

Os óleos de gergelim podem ser fabricados de duas formas: óleo torrado e óleo para salada (não torrado). O óleo para salada é obtido por um extrator e em seguida refinado por tratamento alcalino, lavagem em água, branqueamento com argila ácida e um processo desodorizante. Esses processos de refino são quase iguais aos usados em outros óleos vegetais, como o de milho, de soja, de açafrão e de girassol. Por quantificação usando-se HPLC, constatou-se que o teor de sesaminol aumentou radicalmente durante o processo de manufatura, em especial no processo de branqueamento (Figura 5). O sesaminol é um antioxidante peculiar, devido à sua superior estabilidade ao calor. Também é capaz de retardar a degradação dos tocoferóis no óleo de milho. O sesaminol pode ter efeito sinérgico sobre os tocoferóis durante a oxidação térmica e pode inibir a produção de peróxidos lipídicos nos óleos, embora ainda não estejam claros os detalhes do mecanismo envolvido.¹⁵

O sesaminol mostrou proteção significativa contra os danos oxidativos em vários sistemas in vitro usando-se sistemas de microssomas de fígado de rato e de eritrócitos fantasmas de coelho. Sua ação protetora também foi examinada usando-se fibroblastos diploides humanos cultivados em várias idades in vitro. O nível constitutivo da peroxidação lipídica foi mais elevado nas células das passagens tardias (75% do tempo de vida) do que nas passagens precoces (26% do tempo de vida). A peroxidação lipídica em resposta ao acréscimo de t-butil-hidroperóxido foi mais acentuada em células de passagens tardias, no entanto, a presença de sesaminol efetivamente diminuiu os estímulos de peroxidação mediante um iniciador de peroxidação.¹⁶ Recentemente. Yamashita et al¹⁷ relataram que o sesaminol inibe o dano oxidativo provocado por tetracloreto de carbono usando "ratos com senescência acelerada" (SAM), como sistema in vivo, embora não se tenha concluído experimento de alimentação a longo prazo com sementes de gergelim. Recentemente, os autores constataram que o sesaminol é um forte protetor contra danos ao ADN causados por estresse oxidativo. Embora ainda não se tenha concluído o exame detalhado, constatamos que o sesaminol previne tanto a peroxidação lipídica como a eliminação de 8-hidroxi-2'-deoxiguanosina (8-OH-dG) pela urina, determinada por método de anticorpo monoclonal usando um sistema in vivo.¹⁸ 

As sementes de gergelim também contêm uma grande quantidade de glucosídeos de lignina.¹⁹ As estruturas dos novos glucosídeos de lignina, tais como glucosídeos de pinoresinol antioxidantes²⁰ e glucosídeos de sesaminol²¹ (Figura 6) foram elucidadas.

F6

Foi constatado que esses glucosídeos atuam como fortes antioxidantes solúveis em água, e também como precursores de ligninas antioxidantes solúveis em lipídios. Esse efeito pode ser devido à hidrólise dos glucosídeos de lignina pela enzima β-glucosidase das bactérias intestinais de ratos, levando à liberação de ligninas antioxidantes solúveis em lipídios (Figura 7). Depois de retirados todos os antioxidantes solúveis em lipídios, inclusive o sesaminol e os tocoferóis, por extração com n-hexano, a semente de gergelim foi seca ao ar. Essa dieta de gergelim continha apenas antioxidantes solúveis em água, e absolutamente nenhum antioxidante solúvel em lipídios. Depois de experimentos de alimentação de dois meses, constatou-se que essa dieta de sésamo inibe tanto a peroxidação lipídica no plasma como a eliminação de 8-OH-dG pela urina.¹⁸ Está em andamento uma investigação detalhada. 

Como as membranas das células vermelhas do sangue contêm altas concentrações de lipídios poli-insaturados, avaliamos a atividade antioxidante in vitro de catecóis de chá, por um sistema de ensaio simples e conveniente, usando membranas de eritrócitos fantasmas. Os eritrócitos fantasmas preparados com membranas de células vermelhas do sangue de humanos e coelhos mostraram quase o mesmo grau de peroxidação lipídica induzida por t-butil-hidroperóxido. Portanto, a avaliação dos polifenóis antioxidativos do chá in vitro foi executada usando o sistema de membrana de eritrócito fantasma de coelho. O galato de (-) epicatequina e o galato de (-) epigalocatequina mostraram a proteção mais intensa contra a peroxidação lipídica entre os catecóis de chá. Eram mais ativos que os antioxidantes padrão, α-tocoferol e galato de propila.¹ 

As teaflavinas são dímeros de catecóis formados pela oxidação enzimática durante o processo de fabricação do chá preto. Muitos pesquisadores relataram os efeitos antioxidantes dos catecóis,²² porém poucos relatam as propriedades antioxidantes do chá preto. No sistema de eritrócitos fantasmas, as teaflavinas (Figura 8) mostraram atividade antioxidante mais intensa que o α-tocoferol; mas no sistema microssomal, as teaflavinas mostraram atividade antioxidante menos potente do que o α-tocoferol.

Recentemente, constatou-se que uma combinação de H₂O₂ e citocromo e induz a peroxidação lipídica e a quebra do filamento do ADN. Como as teaflavinas inibiram a clivagem do ADN induzida por H₂O₂ na presença de citocromo e, espera-se que elas protejam contra o dano oxidativo ao ADN nas células. Com efeito, as teaflavinas eliminaram a mutagenicidade induzida por H₂O₂. Entre a teaflavinas, a TF3 (que tem duas hemicadeias de ácido gálico) exibiu a mais forte atividade antioxidante no sistema de eritrócitos fantasma. Mediante detalhada investigação da relação estrutura atividade, concluímos que a hemicadeia de ácido gálico é importante para que as teaflavinas manifestem atividade antioxidante e antimutagenicidade, derivada provavelmente dos efeitos de eliminação dos radicais livres.²³ Extensas investigações provaram a estreita relação entre peróxidos de lipídios e oxigênio ativo e suas implicações deletérias para os sistemas vivos. Agora, o papel protetor de outros antioxidantes solúveis em água em relação à mutagenicidade e à atividade lesiva ao ADN induzida por radicais de oxigênio livre e produtos de peroxidação lipídica está sendo investigado. 

Um Novo Antioxidante 

Embora tenham sido isolados e identificados muitos tipos diferentes de antioxidantes naturais, os grandes antioxidantes naturais são os fenóis vegetais. Recentemente, tivemos êxito na obtenção de um novo tipo de antioxidante que contém tanto uma metade fenólica como uma metade de β-dicetona na mesma estrutura. A tetra-hidro curcumina (Figura 9) é derivada da curcumina por hidrogenação.²⁴

A curcumina, o principal componente do açafrão-da-índia, possui atividade antioxidante e é responsável pela cor amarela do curry. Dois componentes menos importantes também estão presentes. Relatou-se que a curcumina inibe a mutagenicidade mediada por microssoma do benzopireno e 7,12-dimetil benzoantraceno. Mais recentemente, Huang et al²⁵ relataram que a curcumina atua como forte inibidor no desenvolvimento de tumores. Esse efeito parece ser, em linhas gerais, paralelo à atividade antioxidante. Até o presente, comparamos somente a atividade antioxidante dos derivados de curcumina por modelos de alimentos e sistemas de eritrócitos fantasma. A tetra-hidro curcumina, que se mostrou a mais potente, tem quase a mesma estabilidade ao calor que o sesaminol. Agora, está sendo investigada a correlação entre a atividade antioxidante e a antimutagenicidade. 

Conclusão 

O estudo de antioxidantes vegetais endógenos levou ao isolamento de novos antioxidantes solúveis em lipídios, conjugados e ligninas de β-dicetonas e tocoferol. Também foram isolados antioxidantes de materiais vegetais solúveis em água. 

Este artigo foi publicado na revista Cosmetics & Toiletries (Edição em Português), 7(2): 38-43, 1995.
Publicado originalmente em inglês, Cosmetics & Toiletries, outubro 1994.