Mecanismos de Regulagem e Função Estrutural da Pele
publicado em 01/08/1997
Adam B Glick, PhD, Stuart H Yuspa, MD
Laboratory of Cellular Carcinogenesis and Tumor Promotion, National Cancer Institute, Bethesada MD, Estados Unidos
Os recentes avanços obtidos nos meios de cultura celular e na biologia molecular identificaram importantes componentes estruturais da epiderme e diversas moléculas que regulam o crescimento e a diferenciação das células da epiderme.
Estrutura e Função da Pele
Técnicas Modernas para o Estudo da Biologia Cutânea
Equilíbrio Estrutural da Pele
Regulação da Diferenciação Epidérmica
Regulação da Proliferação Epidérmica
Resumo
Recentemente, houve rápido aumento em nossa compreensão sobre os mecanismos de equilíbrio molecular e bioquímica da biologia da pele, impulsionado, em parte, pelos avanços técnicos em uma série de áreas. Atualmente dispomos de métodos confiáveis para isolar e cultivar queratinócitos funcionais da epiderme em ratos e em humanos.
Os queratinócitos humanos podem ser transferidos e expandidos várias vezes, in vitro, em meio de cultura sem soro; entretanto, ainda não é possível realizar o mesmo com células de ratos. Além disso, também é possível induzir, in vitro, um programa de diferenciação de camadas celulares: assim, a regulagem da proliferação e da diferenciação terminal das células epidérmicas pode ser estudada em condições definidas. Foram criados numerosos modelos especiais de cultura, nos quais é produzida epiderme normal estratificada.
Estrutura e Função da Pele
A pele, o maior órgão do corpo, atua como barreira protetora contra o ambiente externo, impedindo a entrada de microrganismos, a absorção de radiação e a perda de água. Consiste em uma camada epitelial superior (epiderme), uma matriz de tecido conectivo inferior (derme) e tecido adiposo (hipoderme). Cada camada contém diferentes tipos e estruturas de células, importantes para a função especial da pele.
Epiderme:
O principal componente da epiderme é a célula epitelial (em contínua renovação) ou queratinócito. A função barreira é exercida pela camada cornificada, o produto final da diferenciação de camada de queratinócito. Os complementos epidérmicos especializados - pelos e glândulas sebáceas e sudoríferas - também derivam da camada epitelial. Além dos queratinócitos, a epiderme contém uma série de células imigrantes. Os melanócitos são células que secretam pigmentos que protegem a pele contra a radiação ultravioleta. As células de Merkel podem ter função neurossensorial. Finalmente, há as células de Langerhans, pertencentes ao sistema imunológico e que podem atuar na proteção contra antígenos ambientais.
Matriz do tecido dérmico:
A matriz do tecido conectivo fornece apoio estrutural para a epiderme, acima dela, bem como para as redes de nervos e vasos. A matriz é composta de células derivadas mesenquimamente (ou fibroblastos). que secretam a rede fibrilar e filamentosa de proteínas que constituem a matriz extracelular. As células do sistema imunológico, tais como os macrófagos e as células suporte, localizam se na derme; pode ocorrer infiltração por linfócitos em reação a determinados estímulos. A derme também protege o corpo contra ferimentos mecânicos, atua como local de armazenamento de água e é importante na regulação térmica e na recepção sensorial. Além disso, a derme é importante na remodelagem e reparo da epiderme.
Membrana de base:
Entre a derme e a epiderme localiza-se a membrana de base, uma estrutura de proteínas especiais. Esta membrana é composta por uma série de moléculas de matriz ubíquas, tais como a laminina, o colágeno tipo IV e o sulfato de heparina proteoglicano, bem com proteínas específicas do epitélio estratificado em escamas. A epiderme é presa à membrana de base através de integrinas, proteínas transmembrana que ligam a matriz extracelular à rede de filamentos de queratina intracelular. Processos como migração, cura de feridas e diferenciação terminal podem, em parte, ser regulados por essa ligação. As fibrilas de ancoragem compostas de colágeno tipo IV ligam a derme e a epiderme conferindo força ao tecido.
Camada basal de células:
Além disso, é provável que ocorram interações entre células epidérmicas e dérmicas, através da membrana de base e reguladas por ela. A proliferação de células na epiderme se limita a camada basal celular, que está em contato com a membrana basal. A migração de células basais para as camadas de células suprabasais está associada à perda da capacidade de proliferação. O subsequente início de um programa sequencial altamente especializado e coordenado de expressão de genes resulta, em última análise, na produção de uma escama inviável ou célula cornificada.
Por exemplo, as células da camada basal expressam um subconjunto específico de filamentos, formando proteínas estruturais, queratinas K5 e K14. Na primeira camada espiniforme, é induzida um par diferente de queratinas, K1 e K10.
Nas camadas celulares superiores, são expressos os constituintes de um invólucro de ligação cruzada, a loricrina e a involucrina, bem como a filagrina, proteína que une os filamentos intermediários, e a enzima epidérmica transglutaminase, importante no processo de ligação cruzada de proteínas para formar o invólucro celular cornificado.
Técnicas Modernas para o Estudo da Biologia Cutânea
O estudo da função das proteínas e genes específicos na biologia cutânea pode ser realizado através de três maneiras importantes.
- Um modelo in vitro pode ser usado para bloquear ou induzir a atividade de enzimas específicas (num enfoque farmacológico, a partir de inibidores ou ativadores químicos), e consequentemente, determinar sua função;
-O uso de retrovírus recombinantes (que podem infectar as células mas não duplicar novos vírus) pode facilitar a introdução de genes específicos nos queratinócitos primários. determinando seu impacto sobre a função celular.
O mais importante é que essas células primárias alteradas (em rato sem pelos) podem ser devolvidas a um ambiente in vivo, através do processo de enxerto de pele. Nessa técnica, as culturas tripsinizadas de queratinócitos primários de ralos ou humanos, são misturadas com fibroblastos primários dérmicos. A pasta de células é depositada no local do enxerto no dorso de um rato sem pelos, preparado pela remoção de um pedaço circular da epiderme e derme hospedeira (Figura 1). Dentro de 1-2 semanas, uma nova epiderme se restabelece a partir das células enxertadas.1 A estrutura e as propriedades bioquímicas da epiderme resultante dependem da origem das células epidérmicas enxertadas. Assim, os queratinócitos humanos restabelecem a epiderme humana no dorso do rato (Figura 2), e as células do rato, de linhagens com propriedades genéticas específicas, retêm essas propriedades quando enxertadas.
Dois dos principais usos dessa técnica foram o estudo do papel de oncogenes específicos na patogênese do câncer de pele e o estudo dos componentes celulares necessários para o desenvolvimento de pelos. Por exemplo, quando botões de folículo capilar, isolados da epiderme do rato recém-nascido, são misturados com células de papilas dérmicas, ocorre exuberante crescimento de pelos no local do enxerto. Ao contrário, os botões de folículo capilar enxertados com fibroblastos dérmicos cultivados (ou linhas de células de fibroblastos) produzem muito pouco pelo. Assim, o crescimento de pelo requer a interação entre dois tipos de células, e estamos usando esse sistema para definir os sinais moleculares envolvidos neste process. 5
- Avanços mais recentes na genética molecular também foram usados para estudar a regulação da biologia cutânea in vivo. Estes incluem o direcionamento do excesso de emissão de genes específicos à epiderme através do uso transgênicos de ratos e a eliminação de genes específicos gera um rato modificado (knockout mouse), ou seja, com reações comportamentais específicas diferenciadas do rato original. Em resumo, os transgênicos direcionados são feitos colocando-se um gene clonado, que pode regular a proliferação ou diferenciação epidérmica sob o controle de um promotor específico da pele, a região de um gene responsável pela regulação de expressão (Figura 3).
Esse elemento cromossômico extra (plasmid) recombinante é, em seguida, microinjetado em um óvulo de rato fertilizado in vitro, que é então reimplantado numa fêmea pseudo-prenha. Se o DNA do cromossomo extra for incorporado ao DNA do óvulo e transmitido pela linha germinativa, uma nova linhagem de ratos é criada, que difere apenas pela nova expressão do gene de interesse na pele.
A tecnologia de knockout envolve a eliminação da região do DNA de um gene de interesse em células ramificadas embrionárias totipotentes (não diferenciadas) cultivadas in vitro (Figura 4). Uma região específica do gene de interesse é substituída por uma recombinação homóloga com sequência idêntica, interrompida com DNA bacteriano. Isto resulta em uma célula com um gene normal e um gene não funcional mutante. As células que possuem eliminação específica são, em seguida, injetadas em um embrião novo de rato (blastócito) e, por causa da totipotência, podem participar do desenvolvimento normal juntamente com as células do embrião. Se incorporadas à linha de germinação, podem ser criadas linhagens de ratos homozigóticos com esta eliminação do gene específico.
Equilíbrio Estrutural da Pele
A importância das proteínas estruturais para a integridade e a função da pele foi elucidada por recentes descobertas de que, nos humanos, muitas doenças cutâneas genéticas resultam de mutações dos genes que codificam essas proteínas. Por exemplo, as doenças que provocam bolhas na pele, Epidermolysis bullosa simplex (EBS) e a hiperqueratose epidermolítica, são provocadas por mutações especificas nas queratinas 14 e 1, respectivamente. O aspecto patológico dessas doenças é a lise da camada celular, na qual a queratina mutante se expressa sob a forma de bolhas, devido à separação da camada afetada das células subjacentes. As mutações de outras proteínas estruturais, como a laminina, o colágeno tipo IV e a integrina alfa-6 também foram associadas a diferentes doenças nas quais as bolhas estão presentes.2
A tecnologia dos ratos transgênicos foi usada para demonstrar a relação causal específica entre mutação genética e patológica. Assim, os ratos transgénicos que expressam o gene humano mutante da queratina 14 na epiderme, desenvolvem doença com bolhas semelhante à EBS.15 Isto reforça a utilidade da tecnologia de ratos transgênicos na transferência de modelos de doenças para humanos, bem como para demonstrar a relevância de determinadas proteínas na diferenciação epidérmica.
Regulação da Diferenciação Epidérmica
Um dos maiores reguladores da diferenciação de camadas celulares in vitro é a concentração de íon de cálcio extracelular. Os queratinócitos primários de ratos apresentam morfologia celular basal e fenótipo proliferativo quando cultivados em - 0.05 mM Ca2+. Se a concentração de Ca2+ for superior a 0,12 mM as células rapidamente deixam de proliferar (Figura 5), pois se estratificam e expressam marcadores de diferenciação espiniforme, tais como as queratinas 1 e 10 e, posteriormente, constituintes de proteína do invólucro cornificado.1
O gradiente do íon de cálcio na epiderme aumenta e sai da amada basal, sugerindo que a concentração de Ca2+ extracelular também é importante para a diferenciação in vivo. O principal efeito do aumento do cálcio extracelular é a elevação dos níveis intracelulares através da liberação de estoques intracelulares. Os agentes que bloqueiam a liberação de cálcio intracelular, tais como os queladores e inibidores de cálcio da ATPase dependente de Ca2+, como a tapsigargina e o ácido ciclopiazônico, também bloqueiam a diferenciação terminal e mantêm as células em um fenótipo celular basal.
Um dos principais efetores do sinal de cálcio é a enzima intracelular quinase de proteína C (PKC). A PKC é, na verdade pertencente à família de quinases de proteína dependentes de fosfolipídios, algumas das quais também dependentes do Ca2+ para atingir atividade máxima. In vitro, os ativadores farmacológicos dessas enzimas, tais como os ésteres forbol, induzem à diferenciação terminal dos queratinócitos primários, enquanto os inibidores podem bloquear a diferenciação terminal mediada por Ca2+. O tratamento tópico da epiderme com ativadores de PKC, induz a hiperplasia regenerativa devido indução da diferenciação terminal.
Como a atividade da PKC in vitro é dependente de lipídios, os lipídios endógenos podem servir como reguladores in vivo da atividade da enzima, e não os agentes farmacológicos usados com mais frequência pelos pesquisadores para ativar essas enzimas.19 O sulfato de colesterol é um lipídio endógeno provavelmente importante na indução da diferenciação terminal mediada por PKC. A produção de sulfato de colesterol é induzida durante a diferenciação in vitro dos queratinócitos, e o lipídio se encontra predominantemente na camada granular da epiderme. Este pode ativar algumas enzimas PKC in vitro e induzir os marcadores da diferenciação terminal. É interessante observar que a doença genética humana ligada ao cromossomo X vincula do à ictiose, distúrbio da descamação de queratinócitos, é associada à presença de altos níveis de sulfato de colesterol no estrato córneo (EC). Assim, os lipídios aplicados topicamente, ou os reguladores da biossíntese de lipídios, podem ter profundos efeitos sobre a estrutura da epiderme.
Outra importante classe de moléculas que regulam a diferenciação epidérmica são à base de vitamina A. Esses retinóides ativam ou inibem a transcrição de genes por meio da união a receptores nucleares específicos (RARs, RXRs) que atuam como fatores de transcrição dependente do ligante. Esses receptores são estruturalmente relacionados a receptores nucleares para hormônios esteróides. O ácido retinóico in vitro inibe a diferenciação terminal dos queratinócitos, enquanto in vivo a aplicação tópica de retinóides induz à hiperplasia e à alteração de padrões da síntese de queratina.2
Além disso, o ácido retinóico tópico acelera o reparo de danos induzidos pela luz ultravioleta na pele de ratos e humanos. Isto pode ser devido, em parte, à expressão alterada das proteínas da matriz extracelular, tanto na epiderme como na derme. 18
Dois modelos de ratos transgénicos demonstraram, recentemente, a importância dos retinóides para a função epidérmica. Em ambos, formas anormais de um dos RARs, que efetivamente bloqueiam a função RAR, foram direcionadas ou para a camada diferenciadora suprabasal ou para a camada basal da epiderme. O bloqueio da atividade RAR nas camadas suprabasais não altera a diferenciação de camadas celulares modificadas, mas resulta numa epiderme anormal, na qual a função barreira se perde, devido ao metabolismo anómalo dos lipídios.6 Ao contrário, o bloqueio da função RAR na camada basal elimina totalmente a diferenciação de camada.
Regulação da Proliferação Epidérmica
A proliferação celular na epiderme e controlada, em parte, pelos fatores de crescimento de polipeptídios, alguns dos quais são produzidos na epiderme, e outros na derme. Os fatores de crescimento são pequenas proteínas secretadas pelas células que se unem a proteínas ou receptores específicos da superfície celular (Figura 6). O receptor deve gerar um sinal de fator de crescimento intracelular específico. A ação dos fatores de crescimento sobre as células é complexa, e cada um deles regula muitas funções celulares, tais como a proliferação, a diferenciação e a produção da matriz extracelular.
• Estimulador de crescimento.
Os membros da família do fator de crescimento epidérmico (EGF) são os principais reguladores positivos da proliferação epidérmica identificados até o momento, Essa família inclui o EGF, transformando o fator-alfa de crescimento (TGF-alfa), a anfirregulina, o EGT de ligação de heparina (HB-EGF) e a beta-celulina. Embora o EGF não se expresse na epiderme, outros membros da família foram detectados.
Todos esses polipeptídios estruturalmente relacionados unem-se ao mesmo receptor de superfície, o receptor EGF (EGFR). A injeção de EGF purificado na epiderme do rato provoca aumento do número de camadas de células viáveis e o espessamento do EC. Uma reação proliferativa semelhante é obtida in vitro, se os queratinócitos humanos ou de ratos forem tratados com membros purificados da família de fator de crescimento. Além disso, a cura de ferimentos artificialmente induzidos é acelerada pelo EGT ou TGF-alfa aplicado topicamente sugerindo que a expressão endógena desses fatores de crescimento participa desse complexo processo.7,11
Mais recentemente, a tecnologia do rato transgênico e modificado proporcionou interessantes pistas sobre a função da família do ligante EGFR na epiderme. A excessiva expressão direcionada de TGF-alfa no compartimento basal da epiderme provoca a hiperproliferação.16 No entanto, os ratos nos quais esse gene foi eliminado não apresentam qualquer efeito sobre a estrutura ou a reação de cura de ferimentos da epiderme. Entretanto, há profunda alteração na estrutura do pelo e no arranjo de folículos de pelo na epiderme.
O pelo e os bigodes dos animais modificados TGF-alfa têm aspecto claramente retorcido. Os folículos, embora não estruturalmente anormais, se dispõem na epiderme de forma desorganizada, e crescem para baixo, inadequadamente, na hipoderme.9 Como o TGF-alfa é expresso no folículo capilar normal, esses resultados sugerem que é importante tanto na formação do fio de cabelo como na orientação do folículo e no crescimento para baixo em direção à derme.
• Regulação por KGF.
O fator de crescimento de queratinócitos (KGF) é o segundo mitógeno das células epidérmicas. É produzido pelos fibroblastos dérmicos que, por si só, não expressam o receptor KGF da superfície (Figura 7).
A expressão de KGF aumenta na derme depois do ferimento; a aplicação tópica de KGF aumenta a taxa de repitelialização do ferimento. Isto pode ser devido ao estímulo da proliferação e migração de queratinócitos pelo KGF, in vitro. É interessante observar que o KGF pode induzir a expressão de TGF-alfa por queratinócitos cultivados, sugerindo que seus efeitos sobre a proliferação possam ser indiretos. Os ratos transgénicos que expressam mutação negativa dominante do KGFR direcionado para a camada basal da epiderme apresentam atrofia epidérmica, proliferação reduzida das células epidérmicas e número reduzido de folículos capilares. Surpreendentemente, esses animais também têm deposição excessiva de tecido conectivo na derme, sugerindo que uma curva de realimentação negativa a partir da epiderme, iniciada pelo KGF, controla a produção da matriz dérmica de fibroblastos. A cura de feridas nesses animais também fica prejudicada, devido à repitelialização incompleta da ferida.17
• Inibidores de crescimento.
O grupo de polipeptídeos estreitamente relacionados, conhecido com os fatores-beta de crescimento de transformação (TGF-beta), estão entre os mais importantes fatores de crescimento para a biologia cutânea. Existem três membros da família TGF-beta - TGF beta 1. beta 2 e beta 3 - cada um deles produto de gene diferente. Todas as células epiteliais em cultura, incluindo os queratinócitos de ratos e humanos, reagem ao TGF-beta exógeno com a supressão da proliferação de células. Os TGF-betas podem bloquear o efeito estimulador de fatores de crescimento positivo, como o EGF/TGF-alfa, mas o efeito é reversível quando os TGF-beta são retirados. Os TGF-beta não induzem diretamente a diferenciação terminal dos queratinócitos; no entanto, evidências de sinergismo com indutores específicos de diferenciação de camada sugerem que as TGF-beta podem desempenhar papel nesse processo. Outros efeitos relatados dos TGF-beta sobre os queratinócitos incluem a indução de proteínas envolvidas na adesão célula-célula e célula-matriz.14
Em meios de cultura que promovem o fenótipo basal celular, os queratinócitos de ratos expressam baixos níveis de TGF-beta 1 mRNA e proteína. Isto reflete a expressão in vivo, na qual o TGF-beta 1, proteína e o mRNA estão presentes na camada basal da epiderme de ratos e humanos. É provável que nestas células, o TGF-beta 1 atue como um regulador negativo autócrino da proliferação celular, já que esta aumenta na epiderme e nos queratinócitos cultivados de ratos, nos quais o gene TGF-beta 1 foi experimentalmente eliminado.5 Evidências adicionais desse faro se originam de ratos transgênicos que especificamente expressam TRGF-beta 1 em excesso na epiderme (Figura 8). Esses animais mortem logo após o nascimento, porque a proliferação celular é totalmente inibida na epiderme e a pele não pode expandir-se com o crescimento do neonato.13
A indução de diferenciação terminal em queratinócitos cultivados resulta no decréscimo da expressão e secreção de TGF-beta 1 e no aumento da expressão de TGF-beta 2 mRNA e secreção de peptídeos. Neste caso também, tanto na epiderme humana como de ratos, a proteína TGF-beta 1 localiza-se especificamente nas camadas suprabasais de células em diferenciação (Figura 9).4 Isto sugere que a expressão de TGF beta na célula suprabasal está envolvida na diferenciação de camada. É possível que a modulação específica da expressão do TGF-beta 1 ou TGE-beta 2 possa modificar a proliferação ou a diferenciação de camada de células na epiderme.
Diversos estudos também localizaram TGF beta 1, TGF beta 2 e TGF-beta 3 nos fibroblastos da derme de ratos e humanos. Ao contrário de sua ação nas células epiteliais, esse fator de crescimento pode atuar como um mitógeno fraco para os fibroblastos. O mais importante é que os TGF-betas são poderosos estimuladores da produção da matriz extracelular pelas células do mesênquima. Foi demonstrado que os TGF-beta aumentam a síntese e a secreção de proteínas da matriz, diminuem a síntese de enzimas proteolíticas que direcionam as proteínas da matriz e aumentam a expressão das proteínas que unem a superfície celular nas moléculas da matriz. Todos esses efeitos sugerem que os TGF-beta podem desempenhar importante papel na remodelação do tecido e na cura de feridas,
Os TGF-beta podem atuar como quimiocaptores das células inflamatórias, significativas produtoras do fator de crescimento. Além disso, o TGF-beta estimula a formação de novos vasos sanguíneos e intensifica a proliferação e a migração de fibroblastos para a ferida pelos queratinócitos. No modelo de cura de feridas da pele humana, o TGF-beta 1 é induzido rapidamente na epiderme ferida e subsequentemente nos vasos sanguíneos nas células inflamatórias e nos fibroblastos da derme. A expressão do TGF-beta 1 é mais elevada nos queratinócitos migrantes da borda da ferida, o que é coerente com sua atuação como estimulador da migração de queratinócitos.14 É interessante observar que os retinóides podem induzir o TGF-beta 1 e o TGF-beta 2 em queratinócitos cultivados e na epiderme, sugerindo importante elo mecânico entre esses dois grupos de moléculas reguladoras da pele.
Resumo
Os recentes avanços obtidos nos meios de cultura celular e na biologia molecular identificaram importantes componentes estruturais da epiderme e diversas moléculas que regulam o crescimento e a diferenciação das células da epiderme. Atualmente, estão sendo realizados estudos em muitos laboratórios para definir o papel que esses genes e proteínas desempenham nos estados normal e patológico da epiderme in vivo.4
Apresentado pela primeira vez na Conferência de Tecnologia Avançada patrocinada pela revista Cosmetics & Toiletries, Paris abril de 1995.
Este artigo foi publicado na revista Cosmetics & Toiletries (Edição em Português), 9(4): 46-53, 1997.
Publicado em inglês, Cosmetics & Toiletries 110(7): 40-48 1995.
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